Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Vi takker D. Braendle, CL Kurz og F. Montañana-Sanchis for deres bidrag. Dette projekt blev støttet af tilskud fra ANR og Conseil Regional PACA, og institutionel finansiering fra INSERM og CNRS.

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li><li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li><li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting.">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li><li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes.">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li><li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+high-throughput+screens:+the+C+elegans+model.">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1551-8507 (2006).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M., Ewbank, J., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+Infection+by+Bacterial+and+Fungal+Pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens.</a> Methods Mol Biol. 415, 403-427 (2008).</li><li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNP-1/ATR-X+acts+with+RB,+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans.">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions.">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li><li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li><li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data.">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li><li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans.">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li><li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20&#47;GCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis.">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20&#47;GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li><li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome.">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+a+dish:+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis.">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li><li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay.">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li><li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2.">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

Den Ewbank Lab samarbejder med EU Biometrica og Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; Den nuværende protokol giver mulighed for i stor skala RNAi screening i<em&gt; C. elegans</em&gt; På faste medier ved hjælp af niveauet af ekspression af en fluorescerende reporter gen som en udlæsning. Det er blevet optimeret med automatiserede værktøjer til at lette high-throughput assays, som muliggør nem og hurtig håndtering af et stort antal prøver i en effektiv, pålidelig og reproducerbar måde. Andre fremgangsmåder er blevet beskrevet som ikke er afhængige så stærkt på automatiseret væskeprøven håndtering<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Et centralt organisatoriske aspekt protokollen har været udviklingen af ​​en robust metode til at prøve sporing ved at tilpasse den kommercielle MBioLIMS software til RNAi skærmen procedure i samarbejde med virksomheden ModulBio. På hvert trin i proceduren, er plader nu identificeret ved stregkoder genereres i lims. Som lims også registrerer identiteten af ​​klonerne i hver brønd på hver plade, der går fra brønd til putative gen er enkel. Og ud over dette, så lims links til samfundet databasen WormBase, direkte adgang til molekylære og funktionelle data om en given gen. Det lims letter også analyser skal udføres på pladen eller endda kromosom og hel-genom niveau. For disse analyser, bliver lagret på en måde, der er fuldt kompatible med tidligere beskrevne værktøjer såsom COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Et kritisk eksperimentelt punkt i fremgangsmåden er justering af mængden af ​​fødevarer i forhold til det antal orme. For mange assays, er det vigtigt, at ormene ikke sulte ved afslutningen af ​​forsøget, men det er også vigtigt ikke at have for meget mad ved starten. Vi har observeret, at en høj densitet af føde nedsætter fluorescens induktion i protokollen med orme bærer p<em&gt; NLP-29</em&gt; :: GFP reporter. Dette kan afspejle en formindsket infektion effektivitet ved orme dyrkes for meget bakterier (BS, upublicerede resultater). Samtidig er dyrkningsbetingelserne for RNAi bakterier også vigtigt, eftersom dette bestemmer, om dsRNA fremstilles på et optimalt niveau. Nogle protokoller for stor skala RNAi kræver dyrkning af RNAi kloner på agarplader inden podning flydende kulturer<sup&gt; 8</sup&gt;. Vi opnåede robust gendæmpning udelade dette trin. Vi valgte til at dyrke et overskud af hver kultur for at sikre ensartede resultater. Protokollen beskrevet i virkeligheden indeholder tilstrækkeligt materiale til at udføre 2 eller 3 skærme parallelt. Af hensyn til at opnå de mest robuste resultater favorisere vi imidlertid, ledende skærm in duplo under anvendelse uafhængige kulturer orme RNAi bakterier og svampesporer.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Anden kritisk trin er relateret til anvendelse af medium, der hverken er for fugtig eller for tør. Hvis pladerne ikke er tør nok, er det RNAi bakterier ikke tørrer korrekt og orme vil svømme under assayet. Dette kan give problemer. For eksempel er orme ikke effektivt inficeres af<em&gt; D. coniospora</em&gt; I flydende (C. Couillault, upublicerede resultater). På den anden side tørre plader. Osmolariteten af ​​dyrkningsmediet forøges Dette har direkte indvirkning på orm fysiologi<sup&gt; 17</sup&gt;, Herunder induktion af visse antimikrobielle peptid gener, såsom<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Volumen anvendes til at dispensere orme og sporer er kritisk for at tillade effektiv og hurtig tørring. Hvis mere end 10 pi væske tilsættes til friske plader, kan brøndene tage mange timer for at tørre. Dette kan betyde, at det er vanskeligt at anvende robot metoder til at tilføje orme til pladerne. For eksempel er hver snekke dispenseres ved Biosort i omkring 1 pi af væske. Vi har i øjeblikket distribuere orme manuelt som også giver os mulighed for at overvinde den tendens orme i opløsning på sediment.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vi har tidligere beskrevet en justering af Biosort som lader en 96-brønds plade, der skal analyseres i 36 minutter<sup&gt; 19</sup&gt;. Maskinens producent UBI tilbyder nu en ændring af Biosort at falde yderligere analysen tid. Med &quot;FastReFlex&quot;, er prøverne direkte ført gennem flowcellen for analyse, at omgå boble-fælde filter. Dette resulterer i en signifikant reduktion i den tid til datafangst, en hel plade kan analyseres i 22 min tillade omkring 20 plader, der skal behandles, per dag. Hvis pladerne ikke er frosset, men ville der være en 8 timers interval mellem de første og sidste dem. Grund af den relativt korte varighed af forsøget, med infektionen varighed kun 18 timer, vil det indføre en uacceptabel variabel over pladerne. Ikke alene fryse plader før analyse løse dette problem, men det er også vigtigt i forbindelse med high-throughput analyser, som med den nuværende protokol og standard væske-håndtering robotter, kan 2 personer nemt behandle op til 50 plader om ugen. I øjeblikket har vi rutinemæssigt skærmen 30 plader om ugen, hvilket giver en hel-genom-skærmskal udføres én gang i mindre end 2 måneder.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Et interessant træk ved denne protokol er den kendsgerning, at den anvender fast agar, således assays, der ikke kan udføres i flydende kultur. Da ormen fysiologi forskellig afhængig af dyrkningsbetingelserne<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Der er i stand til at udføre assays på fast medium kan også supplere sædvanlige væske-baserede skærme. For visse fænotyper (f.eks bevægelse), kan analysen gennemføres direkte med 96 brønde faste mediumplader. For det aktuelle skærmbillede kan imidlertid som Biosort ikke prøven fra faste mediumplader, der orme først overført til væsken før frysning. På den anden side tillader Copas Biosort en multiparametric kvantitativ analyse i overensstemmelse med målingen af ​​mange forskellige fænotyper. Det er sandsynligt, at for en given skærm ikke alle de målte parametre er det primære udlæsning. Ikke desto mindre kan disse målinger være nyttige til adskillige grunde. De tillader en at bestemme, om assayet løb korrekt. For eksempel kan man kontrollere antallet og størrelsen af ​​orme i hver brønd. Kun hvis en RNAi klon skal blokere for vækst eller reproduktion bør der være en afvigelse fra de forventede værdier. Brøndene med mindre end 20 orme eller / og dyr 30% mindre (TOF) sammenlignet med en standarddard kontrol med ingen virkning på vækst (<em&gt; F.eks GFP (RNAi</em&gt;)), Kan udelukkes fra de efterfølgende analyser. Funktionen af ​​disse kloner kan løses ved hjælp af en alternativ protokol, hvori ormene udsættes for RNAI bakterier efter deres udvikling er langt fremskreden<sup&gt; 15</sup&gt;. De forskellige parametre kan også anvendes til at forfine kandidat-gen (HIT) selektion for eksempel at begrænse hits kun dem, der påvirker grøn fluorescens, men ikke rød. Den nøjagtige fremgangsmåde til udvælgelse af hits vil afhænge af typen af ​​skærmen og den nøjagtige udlæsning. I betragtning af kompleksiteten af ​​de data, genereret fra en kvantitativ genom-bredformat, kan samarbejde med en statistiker være påkrævet.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Protokollen beskriver vi let kan tilpasses andre typer af assays. For eksempel ved infektionen trin<em&gt; D. coniospora</em&gt; Kan erstattes af enhver anden patogen stand til at inficere på faste medier. Dette er potentielt anvendelig som vi har fundet, at mange af de virulensfaktorer vigtige for Serratia marcescens infektion i flydende kultur ikke spiller en rolle under infektion på fast medium (E. Pradel, personlig kommunikation). Protokollen er også fuldt kompatibelt med test af kemikalier forbindelser<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Eller at identificere forbindelser med bioaktivitet under anvendelse af forskellige biblioteker af bakterier<sup&gt; 25</sup&gt;, Så bør finde en generel anvendelighed i<em&gt; C. elegans</em&gt; Forskningsverdenen.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Bactopepton </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal klæbefolien </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropyl β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 dybe brønde </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 og flade plade </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brønds runde plade </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracyklin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robot </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copas Biosort </td><td> EU Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lims </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA-interferens er en kraftfuld fremgangsmåde til at forstå genfunktion, især når den udføres ved en hel-genom skala og i en kvantitativ sammenhæng. I C. elegans kan genfunktion slås ned enkelt og effektivt ved tilførsel orme med bakterier, der udtrykker en dsRNA svarende til et specifikt gen 1. Mens oprettelsen af biblioteker af RNAi kloner dækker det meste af C. elegans genomet 2,3 åbnede vejen for ægte funktionelle genomiske studier (se for eksempel 4-7), de fleste etablerede metoder er besværlige. Moy og kolleger har udviklet halvautomatiske protokoller, der letter genom-dækkende skærme 8. Den tilgang er baseret på mikroskopisk billedbehandling og billedanalyse. Her beskriver vi en alternativ protokol for en høj-throughput genom-wide screen, baseret på robothåndtering af bakteriel RNAi kloner, kvantitativ analyse ved hjælp af Copas Biosort (Union Biometrica (UBI)), og enintegreret software: MBioLIMS (Laboratory Information Management System fra Modul-Bio), en teknologi, der giver øget gennemløb for datahåndtering og prøve sporing. Fremgangsmåden tillader skærme, der skal udføres på fast medium-plader. Dette er især vigtigt for visse undersøgelser, såsom dem der vedrører værtspatogene interaktioner i C. elegans, eftersom visse mikrober ikke effektivt at inficere orme i flydende kultur. Vi viser, hvordan fremgangsmåden kan anvendes til at kvantificere betydningen af gener i anti-fungal medfødte immunitet C. elegans. I dette tilfælde afhænger den fremgangsmåde til anvendelse af en transgen stamme, som bærer en epidermal infektion-inducerbare fluorescerende reporter-gen, med GFP under kontrol af promotoren for det antimikrobielle peptid genet NLP 29 og et rødt fluorescerende reporter, som udtrykkes konstitutivt i epidermis. Sidstnævnte tilvejebringer en intern kontrol for den funktionelle integritet af epidermisog uspecifik transgen lyddæmpende 9. Når kontrol orme er inficeret af svampen, de fluorescerer grønt. Vælte ved RNAi et gen påkrævet til NLP 29 ekspression resulterer i formindsket fluorescens efter infektion. Dag, denne protokol tillader mere end 3000 RNAi kloner, der skal testes, og analyseres ugen, hvilket åbner mulighed for screening af hele genomet i mindre end 2 måneder.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Vi beskriver en protokol med<em&gt; C. elegans</em&gt; Og RNAi fodring biblioteker, der tillader automatisk måling af flere parametre, såsom fluorescens, størrelse og opacitet af individuelle orme i en population. Vi giver et eksempel på et skærmbillede til at identificere gener involveret i anti-fungal medfødte immunitet<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Kvantitative og Automatiseret High-throughput genom-dækkende RNAi skærme i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput fysisk kortlægning af kromosomer under anvendelse Automatiseret<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Kemotaksi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biokemisk og High Throughput Mikroskopisk vurdering af Fat Mass i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genom-dækkende Kortlægning af lægemiddel-DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tværbinding af små molekyler til at isolere Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...