Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Wij danken D. Braendle, CL Kurz en F. Montañana-Sanchis voor hun bijdragen. Dit project werd ondersteund door subsidies van de ANR en de Conseil Regional PACA en institutionele financiering van INSERM en het CNRS.

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li><li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li><li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting.">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li><li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes.">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li><li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+high-throughput+screens:+the+C+elegans+model.">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1551-8507 (2006).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M., Ewbank, J., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+Infection+by+Bacterial+and+Fungal+Pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens.</a> Methods Mol Biol. 415, 403-427 (2008).</li><li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNP-1/ATR-X+acts+with+RB,+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans.">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions.">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li><li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li><li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data.">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li><li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans.">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li><li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20&#47;GCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis.">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20&#47;GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li><li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome.">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+a+dish:+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis.">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li><li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay.">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li><li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2.">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

De Ewbank lab werkt samen met Unie Biometrica en Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; De huidige protocol maakt op grote schaal RNAi screening in<em&gt; C. elegans</em&gt; Op vast medium, met het niveau van expressie van een reportergen fluorescerende als uitlezing. Het is geoptimaliseerd met geautomatiseerde tools om high-throughput testen te vergemakkelijken, zodat u gemakkelijk en snel behandelen van grote aantallen monsters, op een efficiënte, betrouwbare en reproduceerbare wijze. Andere methoden zijn beschreven die niet zo sterk afhankelijk geautomatiseerde vloeistofmonster handling<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een belangrijk organisatorisch aspect van het protocol is de ontwikkeling van een robuuste methode van het monster volgen door aanpassing van de commerciële MBioLIMS software om de RNAi-scherm procedure in samenwerking met het bedrijf ModulBio. In elk stadium van de procedure, worden de platen nu door de barcodes worden gegenereerd binnen het LIMS. Als LIMS ook registreert de identiteit van de klonen in elk putje op elke plaat, gaande van en naar vermeende gen eenvoudig. En dan dit, het LIMS links naar de community-database WormBase, die rechtstreeks toegang geeft tot de moleculaire en functionele gegevens over een bepaald gen. Het LIMS vergemakkelijkt ook analyses uit te voeren op de plaat of zelfs chromosoom en hele genoom-niveau. Voor deze analyse worden de gegevens opgeslagen op een wijze die volledig met eerder beschreven hulpmiddelen zoals COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een kritisch experimenteel punt in de werkwijze is de aanpassing van de hoeveelheid voedsel ten opzichte van het aantal wormen. Voor veel assays, is het essentieel dat wormen niet sterven na afloop van het experiment, maar het is ook belangrijk niet te veel voedsel bij de start. Wij hebben opgemerkt dat een hoge dichtheid van voedsel fluorescentie inductie neemt het protocol met wormen die de p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: GFP reporter. Dit kan wijzen op een verminderde infectie-efficiëntie als wormen worden gekweekt in te veel bacteriën (BS, niet gepubliceerde resultaten). Tegelijkertijd is de kweekomstandigheden van RNAi bacteriën is ook belangrijk omdat deze bepaald of dsRNA geproduceerd op een optimaal niveau. Sommige protocollen voor grootschalige RNAi vereisen cultuur van RNAi klonen op agarplaten voorafgaand aan het zaaien vloeibare culturen<sup&gt; 8</sup&gt;. We kregen robuuste gene silencing het weglaten van deze stap. We hebben gekozen voor het kweken van een overmaat aan elke cultuur homogene resultaten te garanderen. Het protocol beschreven in feite voldoende materiaal 2 of 3 schermen voeren parallel. In het belang van het verkrijgen van de meest robuuste resultaten geven we de voorkeur, echter, het uitvoeren van schermen in twee exemplaren, met behulp van onafhankelijke culturen van wormen, RNAi bacteriën en schimmelsporen.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een andere belangrijke stap is gerelateerd aan het gebruik van medium dat is niet te vochtig of te droog. Als de platen niet droog genoeg is, wordt de RNAi bacteriën niet goed drogen en wormen zal zwemmen tijdens de test. Dit kan problemen veroorzaken. Bijvoorbeeld, wormen niet efficiënt besmet<em&gt; D. coniospora</em&gt; In vloeistof (C. Couillault, niet gepubliceerde resultaten). Aan de andere kant, in droge platen, de osmolariteit van het kweekmedium toe. Dit heeft directe gevolgen voor de worm fysiologie<sup&gt; 17</sup&gt;, Inclusief de inductie van enkele antimicrobiële peptide genen, zoals<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Het volume gebruikt om wormen en sporen afzien is cruciaal voor effectieve en snelle droging mogelijk te maken. Als meer dan 10 pi vloeistof wordt toegevoegd aan verse platen kunnen de putten vele uur drogen. Dit kan betekenen dat het moeilijk is robot methoden wormen aan de platen. Zo wordt elke worm afgegeven door de Biosort bij 1 ul vloeistof. Op dit moment handmatig verspreiden de wormen als die ook ons ​​in staat stelt om het overwinnen van de neiging van wormen in oplossing voor sediment.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; We hebben eerder gemeld een aanpassing van de Biosort toe waardoor een 96-well plaat worden geanalyseerd in 36 minuten<sup&gt; 19</sup&gt;. De machine fabrikant UBI biedt nu een wijziging van de Biosort verder verlagen analysetijd. Met de &quot;FastReFlex&quot;, worden monsters direct gerouteerd via de stroom cel voor de analyse, het omzeilen van de bubble-trap filter. Dit resulteert in een aanzienlijke vermindering van de tijd voor dataverwerving, geheel plaat worden geanalyseerd in 22 min waarbij ongeveer 20 platen te behandelen per dag. Als platen werden bevroren, echter, zou er een 8 uur interval tussen de eerste en laatste. Gezien de relatief korte duur van het experiment, waarbij de infectie duurt slechts 18 uur, zou dit een onaanvaardbare variabele te introduceren in platen. Niet alleen vriesplaten voorafgaand aan de analyse op te lossen dit probleem, maar het is ook essentieel in het kader van high-throughput analyses, met het huidige protocol en de standaard vloeistof-handling robots, 2 mensen gemakkelijk kunnen verwerken tot 50 platen per week. Momenteel zijn we regelmatig het scherm 30 platen per week, die het mogelijk maakt een hele genoom-schermeen keer uitgevoerd minder dan 2 maanden.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een interessante eigenschap van dit protocol is dat het vaste agar gebruikt, waardoor assays die niet kunnen worden uitgevoerd in vloeibare kweek. Als worm fysiologie verschilt afhankelijk van de kweekomstandigheden<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Het kunnen uitvoeren van testen op een vast medium kan ook gebruikelijk op vloeistof gebaseerde schermen aan te vullen. Voor bepaalde fenotypen (bijv. beweging), kan de analyse uitgevoerd worden rechtstreeks met de 96-well vast medium platen. Voor het huidige scherm, echter, als de Biosort niet kunnen genieten van een vast medium platen, zijn wormen eerst overgebracht naar vloeibare voor het invriezen. Aan de andere kant COPAS Biosort maakt een Multiparametrische kwantitatieve analyse verenigbaar met de meting van verschillende fenotypen. Het is aannemelijk dat elk scherm niet alle gemeten parameters zullen de primaire uitlezing. Toch kunnen deze metingen nuttig zijn om verschillende redenen. Ze laten ons toe om te bepalen of de test goed liep. Zo kan een controle van het aantal en de grootte van wormen in elk putje. Alleen wanneer een RNAi kloon zou de groei of reproductie te blokkeren moet er een afwijking van de verwachte waarden. Wells met minder dan 20 wormen en / of dieren 30% kleiner (TOF) vergeleken met een standaard controle zonder effect op de groei (<em&gt; Bijvoorbeeld GFP (RNAi</em&gt;)) Worden uitgesloten volgende analyses. De functie van deze klonen kunnen worden aangepakt met behulp van een alternatief protocol, waarin wormen worden blootgesteld aan de RNAi bacteriën na hun ontwikkeling is in een vergevorderd stadium<sup&gt; 15</sup&gt;. De verschillende parameters kunnen ook worden gebruikt voor kandidaat-gen (hit) selectie, verfijnen bijvoorbeeld beperken resultaten alleen die groene fluorescentie maar niet rood beïnvloeden. De exacte methode voor de selectie resultaten zal afhangen van de aard van het scherm en de exacte uitlezing. Gezien de complexiteit van de gegevens die zijn gegenereerd uit een kwantitatieve genoom-breed scherm, kan samenwerking met een statisticus nodig zijn.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Het protocol wordt beschreven kan gemakkelijk worden aangepast aan andere testen. Bijvoorbeeld, bij de infectie stap<em&gt; D. coniospora</em&gt; Kunnen worden vervangen door een ander pathogeen kunnen infecteren vaste media. Dit is mogelijk bruikbaar hebben wij gevonden dat veel van de virulentiefactoren belangrijk Serratia marcescens infectie in vloeibare kweek geen rol spelen tijdens de infectie op vast medium (E. Pradel, persoonlijke communicatie). Het protocol is ook volledig compatibel met het testen van chemische stoffen<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Of identificeren verbindingen met bioactiviteit met verschillende bibliotheken van bacteriën<sup&gt; 25</sup&gt;, Dienen dus zoek een algemene nut in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Onderzoeksgemeenschap.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal zelfklevende film </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSÜ4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 diepe put plaat </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 goed vlakke plaat </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 well ronde plaat </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tecan robot </td><td> Tecan </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Unie Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA-interferentie is een krachtige methode om genfunctie begrijpen, vooral wanneer uitgevoerd bij een hele genoom schaal en in een kwantitatieve context. In C. elegans kan genfunctie worden neergeslagen eenvoudig en efficiënt door toevoer wormen bacteriën expressie van een dsRNA overeenkomt met een specifiek gen 1. Hoewel het oprichten van bibliotheken van RNAi-klonen die het grootste deel van de C. elegans genoom 2,3 opende de weg voor echte functionele genomische studies (zie bijvoorbeeld 4-7), de meeste gevestigde methoden zijn omslachtig. Moy en collega&#39;s hebben ontwikkeld, semi-automatische protocollen waarmee de toegang genoom-brede schermen 8. De aanpak is gebaseerd op microscopische beeldvorming en beeldanalyse. Beschrijven we een alternatieve protocol voor een hoge-doorvoer screen genoom, gebaseerd op robot behandeling van bacteriële RNAi klonen kwantitatieve analyse met COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)) en eengeïntegreerde software: de MBioLIMS (Laboratory Information Management System van Modul-Bio) een technologie die een verhoogde doorvoersnelheid voor gegevensbeheer en monster tracking biedt. De methode maakt het mogelijk schermen te voeren op een vast medium platen. Dit is bijzonder belangrijk voor een aantal studies, zoals adressering gastheer-pathogeen interacties C. elegans, aangezien bepaalde microben niet efficiënt infecteren wormen in vloeibare cultuur. We tonen hoe de werkwijze kan worden gebruikt om het belang van genen kwantificeren schimmelwerende aangeboren immuunsysteem in C. elegans. In dit geval benadering berust op het gebruik van een transgene stam die een epidermale infectie induceerbare fluorescerende reportergen met GFP onder controle van de promotor van het antimicrobiële peptide gen nlp 29 en een rood fluorescent reporter die constitutief wordt uitgedrukt in de epidermis. Deze laatste bevat een interne controle voor de functionele toestand van de huiden niet-specifieke transgene zwijgen 9. Bij de besturing wormen zijn geïnfecteerd door de schimmel ze fluoresceren groen. Kloppen de door RNAi een gen die nodig zijn voor NLP 29 expressie resulteert in verminderde fluorescentie na infectie. Op dit moment wordt in dit protocol maakt het mogelijk meer dan 3.000 RNAi klonen worden getest en geanalyseerd per week, het openen van de mogelijkheid van een screening van het volledige genoom in minder dan 2 maanden.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We beschrijven een protocol met behulp van<em&gt; C. elegans</em&gt; En RNAi voeding bibliotheken die geautomatiseerde meting van meerdere parameters zoals fluorescentie, de grootte en dekking van de individuele wormen in een populatie mogelijk maakt. We geven een voorbeeld van een scherm om genen die betrokken zijn in anti-schimmel aangeboren immuniteit in te identificeren<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genoom-brede gendeleties in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Door High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...