Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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Nous tenons à remercier D. Braendle, CL Kurz et F. Montañana-Sanchis pour leurs contributions. Ce projet a été soutenu par des subventions de l&#39;ANR et le Conseil Régional PACA, et le financement institutionnel de l&#39;INSERM et le CNRS.

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Le laboratoire collabore avec l&#39;Union Ewbank Biometrica et Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; Le protocole actuel permet dépistage à grande échelle dans l&#39;ARNi<em&gt; C. elegans</em&gt; Sur un milieu solide, en utilisant le niveau d&#39;expression d&#39;un gène rapporteur fluorescent en tant que lecture. Il a été optimisé avec des outils automatisés pour faciliter tests à haut débit, permettant une manipulation facile et rapide d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons, d&#39;une manière efficace, fiable et reproductible. D&#39;autres méthodes ont été décrites qui ne reposent pas si lourdement sur la manipulation automatisée des échantillons de liquide<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un aspect clé de l&#39;organisation au protocole a été le développement d&#39;une méthode robuste de suivi des échantillons, en adaptant le logiciel commercial MBioLIMS à la procédure de l&#39;écran ARNi en collaboration avec le ModulBio entreprise. À chaque étape de la procédure, les plaques sont désormais identifiés par un code barre généré dans le LIMS. Comme le LIMS enregistre également l&#39;identité des clones dans chaque puits sur chaque plaque, allant de bien à gène putatif est simple. Et au-delà de cela, les liens LIMS à la base de données WormBase communauté, permettant un accès direct à des données moléculaires et fonctionnelles sur un gène donné. Le LIMS facilite également les analyses à effectuer sur la plaque ou même au niveau des chromosomes et du génome entier. Pour ces analyses, les données sont stockées d&#39;une manière qui est tout à fait compatible avec les outils décrits précédemment comme COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un point critique dans la méthode expérimentale est l&#39;ajustement de la quantité de nourriture par rapport au nombre de vers. Pour de nombreux tests, il est essentiel que les vers ne meurent pas de faim à la fin de l&#39;expérience, mais il est également important de ne pas avoir trop de nourriture au début. Nous avons observé qu&#39;une forte densité de nourriture diminue l&#39;induction de fluorescence dans le protocole en utilisant des vers portant le p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: Rapporteur GFP. Cela peut refléter une diminution de l&#39;efficacité d&#39;infection lorsque les vers sont cultivées dans des bactéries trop (BS, résultats non publiés). Dans le même temps, les conditions de culture de la bactérie ARNi est également important, car cela détermine si ARNdb est produite à un niveau optimal. Certains protocoles à grande échelle exigent l&#39;ARNi culture de clones ARNi sur gélose avant l&#39;ensemencement des cultures liquides<sup&gt; 8</sup&gt;. Nous avons obtenu gene silencing robuste en omettant cette étape. Nous avons opté pour un excès de croissance de chaque culture pour assurer des résultats homogènes. Le protocole décrit prévoit en effet suffisamment de matière pour effectuer 2 ou 3 écrans en parallèle. Dans l&#39;intérêt d&#39;obtenir les résultats les plus robustes, nous privilégions, cependant, la réalisation d&#39;écrans en double en utilisant des cultures indépendantes de vers, bactéries et spores fongiques ARNi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Une autre étape essentielle est liée à l&#39;utilisation de moyennes qui ne soit ni trop humide ni trop sec. Si les plaques ne sont pas assez sèches, la bactérie ARNi ne se dessèche pas correctement et les vers de se baigner pendant l&#39;essai. Cela peut causer des problèmes. Par exemple, les vers ne sont pas efficacement infectées par le<em&gt; D. coniospora</em&gt; Dans un liquide (C Couillault, résultats non publiés). D&#39;autre part, dans des plaques sèches, l&#39;osmolarité du milieu augmente la culture. Cela a des effets directs sur la physiologie ver<sup&gt; 17</sup&gt;, Comprenant l&#39;induction de certains gènes peptides antimicrobiens, tels que<em&gt; 29 nlp</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Le volume utilisé pour distribuer les vers et les spores est essentielle pour permettre un séchage efficace et rapide. Si plus de 10 uL de liquide est ajouté à des plaques fraîches, les puits peuvent prendre plusieurs heures pour sécher. Cela peut signifier qu&#39;il est difficile d&#39;utiliser des méthodes robotiques pour ajouter des vers sur les plaques. Par exemple, chaque ver est distribué par le Biosort dans l&#39;ordre de 1 pl de liquide. Nous distribuons actuellement les vers manuellement que nous permet aussi de surmonter la tendance de vers en solution dans les sédiments.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nous avons déjà indiqué un ajustement de la Biosort qui permettrait à une plaque de 96 puits à analyser en 36 minutes<sup&gt; 19</sup&gt;. Fabricant de la machine UBI offre maintenant une modification de la Biosort à diminuer encore le temps d&#39;analyse. Avec le &quot;FastReFlex&quot;, les échantillons sont directement acheminé à travers la cellule d&#39;écoulement pour l&#39;analyse, en contournant le filtre à bulles-piège. Il en résulte une réduction significative du temps d&#39;acquisition de données; une plaque entière peut être analysé en 22 min permettant d&#39;environ 20 plaques à traiter par jour. Si les plaques ne sont pas gelés, cependant, il y aurait un intervalle de 8 heures entre les premiers et le dernier. Étant donné la durée relativement courte de l&#39;expérience, avec l&#39;infection qui dure seulement 18 heures, cela pourrait introduire une variable inacceptable dans les plaques. Non seulement les plaques de gel avant l&#39;analyse résoudre ce problème, mais il est également essentiel dans le contexte de l&#39;analyse à haut débit que, avec le protocole standard actuel et de manutention de liquides robots, 2 personnes peuvent facilement traiter jusqu&#39;à 50 plaques par semaine. Actuellement, nous avons l&#39;habitude d&#39;écran 30 plaques par semaine, ce qui permet un écran l&#39;ensemble du génomedoivent avoir lieu en moins de 2 mois.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Une caractéristique intéressante de ce protocole est le fait qu&#39;il utilise la gélose solide, permettant des dosages qui ne peuvent être réalisées en milieu liquide. Comme la physiologie ver diffère selon les conditions de culture<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Être capable de réaliser des tests sur milieu solide peut également compléter habituelles à base de liquide écrans. Pour certains phénotypes (par exemple le mouvement), l&#39;analyse peut être effectuée directement avec des plaques de milieu de 96 puits solides. Pour l&#39;écran actuel, cependant, que le Biosort ne pouvons pas échantillonner à partir des plaques de milieu solide, les vers sont d&#39;abord transférés à l&#39;état liquide avant de le congeler. D&#39;autre part, le Biosort COPAS permet une analyse multiparamétrique quantitative compatible avec la mesure de nombreux phénotypes différents. Il est probable que, pour n&#39;importe quel écran donnée ne sont pas tous les paramètres mesurés sera le premier de lecture. Néanmoins, ces mesures peuvent être utiles pour plusieurs raisons. Ils permettent de déterminer si le dosage se sont déroulées correctement. Par exemple, on peut vérifier sur le nombre et la taille des vers dans chaque puits. Ce n&#39;est que lorsque un clone ARNi devrait bloquer la croissance ou la reproduction doit y avoir un écart par rapport aux valeurs attendues. Wells avec moins de 20 vers ou / et des animaux 30% plus petites (TOF) par rapport à un stanstandard de contrôle sans effet sur la croissance (<em&gt; Par exemple GFP (ARNi</em&gt;)) Peuvent être exclus des analyses ultérieures. La fonction de ces clones peuvent être traitées en utilisant un protocole alternatif dans lequel les vers sont exposés à des bactéries ARNi après leur développement est bien avancé<sup&gt; 15</sup&gt;. Les différents paramètres peuvent également être utilisés pour affiner gène candidat (hit) de sélection, par exemple, limiter coups seulement à ceux qui ont une incidence fluorescence verte, mais pas rouge. La méthode choisie pour la sélection précise succès dépendra du type d&#39;écran et de son exacte de lecture. Compte tenu de la complexité des données générées à partir d&#39;un génome quantitative, grand écran, la collaboration avec un statisticien peut être nécessaire.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Le protocole que nous décrivons peut être facilement adaptée à d&#39;autres types de tests. Par exemple, lors de l&#39;étape d&#39;infection<em&gt; D. coniospora</em&gt; Pourrait être remplacé par n&#39;importe quel autre agent pathogène capable d&#39;infecter sur des supports solides. Ce peut être utile comme nous l&#39;avons constaté que bon nombre des facteurs de virulence importants pour l&#39;infection à Serratia marcescens dans une culture liquide ne jouent pas un rôle lors de l&#39;infection en milieu solide (E. Pradel, communication personnelle). Le protocole est également totalement compatible avec les tests de composés chimiques<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Ou pour identifier des composés à la bioactivité l&#39;utilisation de bibliothèques différentes de bactéries<sup&gt; 25</sup&gt;, Devrait donc trouver une utilité générale dans le<em&gt; C. elegans</emCommunauté de la recherche&gt;.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Bactopeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Film adhésif AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylique β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits profond </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits à plat </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits rond </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tétracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robots </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Union Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

L&#39;ARN interférence est une méthode puissante pour comprendre la fonction des gènes, en particulier quand elles sont menées à une échelle du génome entier et dans un contexte quantitatif. Dans C. elegans, la fonction du gène peut être renversé simplement et efficacement en se nourrissant les vers avec des bactéries exprimant un ARN double brin correspondant à un gène spécifique 1. Alors que la création de bibliothèques de clones d&#39;ARNi couvrant la plupart des C. elegans génome 2,3 ouvert la voie à de véritables études génomiques fonctionnelles (voir, par exemple 4-7), la plupart des méthodes établies sont laborieuses. Moy et ses collègues ont mis au point des protocoles semi-automatiques qui facilitent l&#39;échelle du génome écrans 8. L&#39;approche repose sur l&#39;imagerie microscopique et l&#39;analyse d&#39;image. Nous décrivons ici un protocole alternatif pour un haut débit du génome, grand écran, basée sur la manipulation robotique de clones bactériens ARNi, une analyse quantitative à l&#39;aide de la Biosort COPAS (Union Biometrica (UBI)), et unelogiciel intégré: l&#39;MBioLIMS (Laboratory Information Management System de Modul-Bio) une technologie qui offre un débit plus élevé pour la gestion des données et le suivi des échantillons. Procédé permettant écrans à être effectuée sur des plaques de milieu solide. Ceci est particulièrement important pour certaines études, comme celles portant sur ​​les interactions hôte-pathogène dans C. elegans, car certains microbes ne sont pas efficacement infecter des vers dans une culture liquide. Nous montrons comment la méthode peut être utilisée pour quantifier l&#39;importance des gènes dans les anti-fongiques l&#39;immunité innée dans C. elegans. Dans ce cas, l&#39;approche repose sur l&#39;utilisation d&#39;une souche transgénique portant un épiderme infection inductible du gène rapporteur fluorescent, avec la GFP sous le contrôle du promoteur du gène du peptide antimicrobien de la PNL 29 et un journaliste en rouge fluorescent qui est exprimé de façon constitutive dans le épiderme. Celle-ci prévoit un contrôle interne pour l&#39;intégrité fonctionnelle de l&#39;épidermeet non spécifique du transgène taire 9. Lorsque les vers de contrôle sont infectées par le champignon, ils émettent une fluorescence verte. Abattre par ARNi d&#39;un gène requis pour des résultats nlp expression 29 de fluorescence diminuée après l&#39;infection. Actuellement, ce protocole permet à plus de 3000 clones d&#39;ARNi à être testé et analysé par semaine, ouvrant la possibilité de filtrer l&#39;ensemble du génome en moins de 2 mois.

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Nous décrivons un protocole à l&#39;aide<em&gt; C. elegans</em&gt; Et les bibliothèques d&#39;alimentation ARNi qui permet la mesure automatisée de plusieurs paramètres tels que la fluorescence, la taille et l&#39;opacité de chaque ver dans une population. Nous donnons un exemple d&#39;un écran pour identifier les gènes impliqués dans la lutte contre l&#39;immunité innée dans fongique<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l&#39;échelle écrans ARNi dans C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

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Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

La cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...