Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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Wir danken D. Braendle, CL Kurz und F. Montañana-Sanchis für ihre Beiträge. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem ANR und dem Conseil Regional PACA und institutionelle Förderung von INSERM und CNRS unterstützt.

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Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

Das Labor arbeitet mit Ewbank Union Biometrica und Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; Das aktuelle Protokoll ermöglicht großflächige RNAi-Screening in<em&gt; C elegans</em&gt; Auf festen Medien, unter Verwendung des Niveaus der Expression von einem fluoreszierenden Reporter-Gen als ein Auslesen. Es wurde mit automatisierten Tools optimiert worden, um Hochdurchsatz-Assays ermöglichen, was eine einfache und schnelle Handhabung einer großen Zahl von Proben, in einer effizienten, zuverlässigen und reproduzierbaren Art und Weise. Andere Methoden sind beschrieben worden, dass nicht so stark auf automatisierte Handhabung flüssige Probe<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein wichtiger organisatorischer Aspekt des Protokolls war die Entwicklung einer robusten Methode der Probe-Tracking durch die Anpassung der kommerziellen MBioLIMS Software zur RNAi-Screen Verfahren in Zusammenarbeit mit der Firma ModulBio. In jedem Stadium des Verfahrens werden die Platten nun von Barcodes innerhalb des LIMS generiert identifiziert. Da die LIMS zeichnet auch die Identität der Klone in jeder Vertiefung auf jeder Platte, und zwar von gut putativen Gens ist einfach. Und darüber hinaus, so dass die LIMS-Anbindung an die Datenbank der Gemeinschaft WormBase, direkter Zugang zum molekularen und funktionellen Daten über ein bestimmtes Gen. Das LIMS ermöglicht auch Analysen auf der Platte oder sogar Chromosom und des gesamten Genoms Ebene geführt werden. Für diese Analysen werden die Daten in einer Weise, die vollständig kompatibel mit zuvor beschriebenen Instrumente wie COPAmulti ist gespeicherten<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein kritischer Punkt in der experimentellen Verfahren ist die Einstellung der Menge des Lebensmittels relativ zu der Anzahl von Würmern. Für viele Tests ist es wichtig, dass Würmer nicht am Ende des Experiments verhungern aber es ist auch wichtig, nicht zu viel zu essen zu Beginn haben. Wir haben beobachtet, dass eine hohe Dichte von Lebensmitteln Fluoreszenzinduktion abnimmt in dem Protokoll mit Schnecken tragenden p<em&gt; NLP-29</em&gt; :: GFP-Reporter. Dies könnte auf eine verminderte Effizienz Infektion, wenn Würmer in zu viel Bakterien kultiviert werden (BS, unveröffentlichte Ergebnisse). Gleichzeitig ist die Kulturbedingungen der RNAi-Bakterien auch wichtig, da sie bestimmt, ob dsRNA auf einem optimalen Niveau erzeugt wird. Einige Protokolle für eine groß angelegte RNAi erfordern Kultur der RNAi-Klone auf Agarplatten vor Aussaat Flüssigkulturen<sup&gt; 8</sup&gt;. Wir erhalten robuste Gen-Silencing Weglassen diesen Schritt. Wir entschieden uns für den Anbau eines Überschusses von jeder Kultur, um eine homogene Ergebnisse zu gewährleisten. Das in der Tat beschrieben wird, liefert genügend Material Anspruch 2 oder 3 Bildschirme parallel durchzuführen. Im Interesse der Erlangung der robustesten Ergebnisse bevorzugen wir jedoch, die Durchführung von Bildschirmen in zweifacher Ausfertigung mit unabhängigen Kulturen von Würmern, RNAi-Bakterien und Pilzsporen.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein weiterer kritischer Schritt ist die Verwendung von Medium, das weder zu feucht noch zu trocken ist, verwandt. Wenn die Platten nicht trocken genug sind, wird die RNAi-Bakterien nicht richtig trocknen und Würmer werden während des Tests zu schwimmen. Dies kann Probleme verursachen. Zum Beispiel werden Würmer nicht effizient infiziert<em&gt; D. coniospora</em&gt; In Flüssigkeit (C Couillault, unveröffentlichte Ergebnisse). Auf der anderen Seite, auf trockener Platten, die Osmolarität der Kulturmedium erhöht. Dies hat direkte Auswirkungen auf Wurm Physiologie<sup&gt; 17</sup&gt;, Einschließlich der Induktion von einigen antimikrobiellen Peptid-Gene, wie z. B.<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Das Volumen verwendet, um Würmer und Sporen zu verzichten ist entscheidend für die effektive und schnelle Trocknung zu ermöglichen. Wenn mehr als 10 l Flüssigkeit auf frische Platten hinzugefügt wird, können die Brunnen viele Stunden dauern, um zu trocknen. Dies kann bedeuten, dass es schwierig, Roboter-Methoden verwenden, um Würmer zu den Platten hinzuzufügen ist. Zum Beispiel wird jeder Wurm durch die Biosort in der Umgebung von 1 ul Flüssigkeit abgegeben. Aktuell vertreiben wir die Würmer manuell als dass erlaubt uns auch, die Tendenz von Würmern in der Lösung in das Sediment zu überwinden.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir zuvor berichtet eine Anpassung der Biosort das erlaubt eine 96-Well-Platte auf in 36 Minuten analysiert werden<sup&gt; 19</sup&gt;. Die Maschinenhersteller UBI nun eine Änderung der Biosort zur weiteren Verringerung der Messzeit. Mit dem &quot;FastReFlex&quot;, werden die Proben direkt durch die Flußzelle zur Analyse weitergeleitet, unter Umgehung des Bubble-Sperrfilter. Dies führt zu einer erheblichen Verringerung der Zeit für die Datenerfassung, eine gesamte Platte kann in 22 min ermöglicht etwa 20 Platten pro Tag behandelt werden analysiert werden. Wenn die Platten nicht eingefroren wurden, jedoch würde es eine 8-Stunden-Intervall zwischen dem ersten und letzten sein. Angesichts der relativ kurzen Dauer des Experiments, mit der Infektion dauert nur 18 Stunden, wäre dies eine unzulässige Variable über Platten einzuführen. Nicht nur, dass das Einfrieren Platten vor der Analyse dieses Problem lösen, aber es ist auch wichtig, im Rahmen der High-Throughput-Analysen, mit dem aktuellen Protokoll und Standard-Liquid-Handling-Roboter, 2 Personen problemlos verarbeiten kann bis zu 50 Platten pro Woche. Derzeit haben wir routinemäßig Bildschirm 30 Platten der Woche, die einen gesamten Genoms Bildschirm ermöglichtauf einmal in weniger als 2 Monate durchgeführt werden.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein interessantes Merkmal dieses Protokolls ist die Tatsache, dass es feste Agar verwendet, so dass Tests, die nicht in flüssiger Kultur durchgeführt werden können. Als Wurm Physiologie unterscheidet sich in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Leistung bringen zu können Assays, die auf einem festen Medium kann auch ergänzen üblichen Flüssig-Bildschirme. Für bestimmte Phänotypen (zB Bewegung), kann die Analyse dann direkt mit 96-Well-Platten festen Medium durchgeführt. Für den aktuellen Bildschirm jedoch als Biosort kann nicht von einem festen Medium Platten Probe werden Würmer erste Flüssigkeit vor dem Einfrieren zu übertragen. Auf der anderen Seite ermöglicht die COPAS Biosort eine Multiparameter quantitative Analyse mit der Messung der Vielzahl von Phänotypen. Es ist wahrscheinlich, dass für einen bestimmten Bildschirm nicht alle gemessenen Parameter wird die primäre Auslesen sein. Dennoch können diese Messungen aus verschiedenen Gründen nützlich. Sie ermöglichen, zu bestimmen, ob der Assay richtig ausgeführt. Zum Beispiel kann man auf der Anzahl und Größe von Würmern in jeder Vertiefung zu überprüfen. Nur dort, wo ein RNAi-Klon soll Wachstum oder Fortpflanzung blockieren sollte es eine Abweichung von den erwarteten Werten sein. Wells mit weniger als 20 Würmer oder / und Tiere 30% kleiner (TOF) mit einem Standard verglichendard Kontrolle ohne Auswirkungen auf das Wachstum (<em&gt; ZB GFP (RNAi</em&gt;)) Kann von weiteren Analysen ausgeschlossen werden. Die Funktion dieser Klone können adressiert mit einer alternativen Protokoll, wobei Würmer zur RNAi-Bakterien ausgesetzt sind, werden nach ihrer Entwicklung ist weit fortgeschritten<sup&gt; 15</sup&gt;. Die verschiedenen Parameter können auch verwendet werden, um Kandidaten-Gen (HIT) Auswahl, zum Beispiel zu verfeinern, die Begrenzung Treffern nur jenen, die grüne Fluoreszenz, aber nicht rot zu beeinflussen. Die genaue Methode zur Auswahl gewählt wird, gespielt von der Art des Bildschirms und sein genaue Auslesen ab. Angesichts der Komplexität der Daten aus einer quantitativen genomweiten Screen erzeugt, kann die Zusammenarbeit mit einem Statistiker erforderlich sein.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Das Protokoll beschreiben wir können leicht auf andere Arten von Tests angepasst werden. Zum Beispiel, an der Infektionsstelle Schritt<em&gt; D. coniospora</em&gt; Konnte von keinem anderen Erreger in der Lage, auf festen Medien infizieren ersetzt werden. Dies ist möglicherweise sinnvoll, da wir festgestellt, dass viele der Virulenzfaktoren wichtig für Serratia marcescens-Infektion in flüssiger Kultur spielen keine Rolle bei der Infektion auf festem Medium (E. Pradel, persönliche Mitteilung) haben. Das Protokoll ist auch vollständig kompatibel mit Tests von Chemikalien Verbindungen<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Oder um Verbindungen mit Bioaktivität mit verschiedenen Bibliotheken von Bakterien identifizieren<sup&gt; 25</sup&gt;, So sollten Sie einen allgemeinen Nutzen in der<em&gt; C elegans</em&gt; Forschungs-Community.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Bactopepton </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal Klebefolie </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropyl β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96-well-Platte </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platte flach </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Loch-Runde Platte </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN Roboter </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Union Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA-Interferenz ist eine leistungsfähige Methode, um Genfunktionen zu verstehen, besonders wenn bei einer gesamten Genoms Maßstab und in einem quantitativen Rahmen durchgeführt. In C. elegans kann Genfunktion sich einfach und effizient durch Zuführen Würmer mit Bakterien Expression eines dsRNA entsprechend einer spezifischen Gen-1 geklopft. Während die Erstellung von Bibliotheken von RNAi-Klone für die meisten der C. elegans Genom 2,3 öffnete den Weg für echte funktionelle Genom-Studien (siehe z. B. 4-7), sind die meisten etablierten Methoden mühsam. Moy und Kollegen haben halbautomatische Protokolle, die Genom-weiten Screens erleichtern 8 entwickelt. Der Ansatz stützt sich auf mikroskopische Bildgebung und Bildanalyse. Hier beschreiben wir ein alternatives Protokoll für eine Hochdurchsatz-Genom-weite Bildschirm auf Roboter-Handhabung von bakteriellen RNAi Klone, die quantitative Analyse unter Verwendung COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)) auf, und einintegrierte Software: Die MBioLIMS (Laboratory Information Management System von Modul-Bio) eine Technologie, die einen erhöhten Durchsatz für Datenmanagement und Sample Tracking bietet. Das Verfahren ermöglicht Bildschirme auf festem Medium-Platten durchgeführt werden. Dies ist besonders wichtig für einige Studien, wie jene Adressierung Wirt-Pathogen-Interaktionen in C. elegans, da bestimmte Mikroben nicht effizient infizieren sich Würmer in flüssiger Kultur. Wir zeigen, wie das Verfahren verwendet werden, um die Bedeutung von Genen in Anti-Pilz-angeborenen Immunität bei C zu quantifizieren elegans. In diesem Fall setzt der Ansatz auf der Verwendung eines transgenen Stamm, der eine epidermale Infektion-induzierbaren fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem GFP unter der Kontrolle des Promotors des antimikrobiellen Peptid-Gen nlp 29 und einem roten fluoreszierenden Reporter, die konstitutiv in das exprimierte Epidermis. Letzteres bietet ein internes Kontrollsystem für die funktionelle Integrität der Epidermisund unspezifische Transgen-Silencing 9. Als Kontrolle Würmer durch den Pilz infiziert sind sie fluoreszieren grün. Der Zuschlag von RNAi ein Gen für NLP-29 führt zu einer verminderten Expression Fluoreszenz nach der Infektion erforderlich. Derzeit können dieses Protokoll mehr als 3.000 RNAi Klone getestet und pro Woche analysiert werden, die Möglichkeit eröffnet, zum Screenen das gesamte Genom in weniger als 2 Monate.

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Wir beschreiben ein Protokoll mit<em&gt; C elegans</em&gt; Und RNAi Fütterung Bibliotheken, die eine automatisierte Messung mehrerer Parameter, wie Fluoreszenz, Größe und die Trübung der einzelnen Würmern in einer Population erlaubt. Wir geben ein Beispiel eines Bildschirms, um Gene in Anti-Pilz-angeborenen Immunität beteiligt sind<em&gt; C elegans</em&gt;.

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Forschung

Biologie

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...