Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

אנו מודים ד Braendle, CL קורץ ופ Montañana-סאנצ&#39;יס על תרומתם. פרויקט זה נתמך על ידי תרומות של ANR ו האזורית Conseil PACA, ואת המימון המוסדי מ INSERM ואת CNRS.

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li><li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li><li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting.">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li><li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes.">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li><li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+high-throughput+screens:+the+C+elegans+model.">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1551-8507 (2006).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M., Ewbank, J., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+Infection+by+Bacterial+and+Fungal+Pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens.</a> Methods Mol Biol. 415, 403-427 (2008).</li><li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNP-1/ATR-X+acts+with+RB,+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans.">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions.">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li><li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li><li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data.">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li><li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans.">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li><li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20&#47;GCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis.">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20&#47;GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li><li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome.">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+a+dish:+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis.">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li><li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay.">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li><li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2.">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

המעבדה משתפת פעולה עם האיחוד Ewbank Biometrica Modul ו-Bio.

<p class="jove_content"&gt; בפרוטוקול הנוכחי מאפשר בקנה מידה גדול ההקרנה RNAi ב<em&gt; ג elegans</em&gt; על התקשורת מוצקים, באמצעות רמת הביטוי של הגן כתב ניאון כמו לקריאה החוצה. זה כבר מותאם עם כלים אוטומטיים כדי להקל על מבחני תפוקה גבוהה, ומאפשר טיפול קל ומהיר של מספר גדול של דגימות, באופן יעיל, אמין לשחזור. שיטות אחרות תוארו שאינם מסתמכים במידה כה רבה על טיפול אוטומטי מדגם נוזלי<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; היבט אחד הארגוני המפתח בפרוטוקול היה פיתוח של שיטת החזקה של מעקב אחר מדגם של התאמת תוכנה מסחרית MBioLIMS להליך מסך RNAi בשיתוף עם ModulBio החברה. בכל שלב של ההליך, צלחות מזוהים כעת ע&quot;י ברקודים שנוצר בתוך LIMS. כמו LIMS גם מתעדת את זהותם של שיבוטים של כל אחד גם על כל צלחת, הולך מבאר לגן המשוערת היא פשוטה. ומעבר זה, את הקישורים LIMS ל WormBase באתר הקהילה, המאפשר גישה ישירה לנתונים מולקולרית ופונקציונלית על הגן נתון. LIMS גם מאפשר ניתוח להתנהל על הצלחת או אפילו ברמה כרומוזום ו-הגנום כולו. עבור ניתוחים אלה, הנתונים מאוחסנים באופן התואם לחלוטין את הכלים שתוארו קודם לכן, כגון COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; נקודה אחת ניסיוני קריטי השיטה היא התאמת כמות המזון ביחס למספר של תולעים. מבחני רבות, חיוני כי תולעים לא למות מרעב בסוף הניסוי, אך חשוב גם לא להיות יותר מדי אוכל בהתחלה. ראינו כי צפיפות גבוהה של מזון פוחתת הקרינה אינדוקציה בפרוטוקול באמצעות תולעים הנושאים עמ &#39;<em&gt; NLP-29</em&gt; :: כתב ה-GFP. זה עשוי לשקף את היעילות זיהום פחתה כאשר תולעים זה בתרבית חיידקים יותר מדי (BS, תוצאות שלא פורסמו). יחד עם זאת, התנאים והתרבות של חיידקים RNAi הוא גם חשוב, כי זה קובע אם dsRNA מופק ברמה אופטימלית. כמה פרוטוקולים בקנה מידה גדול RNAi דורשים תרבות של RNAi שיבוטים על צלחות אגר לפני זריעת תרבויות נוזלי<sup&gt; 8</sup&gt;. קיבלנו להשתקת גנים חזקים השמטת שלב זה. בחרנו לגידול העודף של כל תרבות על מנת להבטיח תוצאות הומוגניות. פרוטוקול תיאר למעשה מספק חומר מספיק כדי לנהל את 2 או 3 מסכים במקביל. למען השגת תוצאות חזקות ביותר, אנחנו בעד, לעומת זאת, מנהלת מסכי בשני עותקים באמצעות תרבויות עצמאיות של תולעים, חיידקים RNAi ו נבגי פטריות.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; שלב קריטי נוסף קשור באמצעות מדיום שאינו לח מדי ולא יבש מדי. אם הצלחות לא יבשים מספיק, חיידקים RNAi לא להתייבש כראוי תולעים ישחו במהלך assay. זה יכול לגרום לבעיות. לדוגמה, תולעים לא נגועים בצורה יעילה על ידי<em&gt; ד coniospora</em&gt; בנוזל (כ Couillault, תוצאות שלא פורסמו). מצד שני, צלחות יבשות, osmolarity של עליות בינוני תרבות. זה יש השפעות ישירות על הפיזיולוגיה תולעת<sup&gt; 17</sup&gt;, כולל אינדוקציה של כמה גנים פפטיד מיקרוביאלית, כגון<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. נפח בשימוש לוותר תולעים נבגי הוא קריטי כדי לאפשר ייבוש יעיל ומהיר. אם יותר מ 10 μL של נוזל נוסף צלחות טריים, בארות את יכולה לקחת הרבה שעות לייבוש. זה יכול להיות שקשה להשתמש בשיטות רובוטיות כדי להוסיף תולעים ללוחות. לדוגמה, תולעת זו היא לוותר על Biosort ב μL סביב 1 של נוזל. בשלב זה אנו להפיץ את התולעים באופן ידני כמו גם מאפשר לנו להתגבר על הנטייה של תולעים פתרון משקעים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אנחנו קודם לכן דיווחו התאמת Biosort שאיפשר 96-1 גם הצלחת להיות מנותח ב -36 דקות<sup&gt; 19</sup&gt;. יצרנית UBI מכונת מציעה כעת שינוי של Biosort כדי להקטין עוד יותר את זמן הניתוח. עם &quot;FastReFlex&quot;, דגימות מנותבים ישירות דרך התא זרימה לניתוח, תוך עקיפת המסנן בועות המלכודת. התוצאה היא הפחתה משמעותית של זמן עבור רכישת נתונים, צלחת שלמה יכול להיות מנותח 22 דקות המאפשר כ -20 צלחות להיות מטופלים ליום. אם הצלחות לא הוקפאו, לעומת זאת, לא היה מרווח 8 שעות בין הראשונים והאחרונים. לאור משך הזמן הקצר יחסית של הניסוי, עם זיהום שנמשך רק 18 שעות, זה היה להציג את המשתנה מקובל על צלחות. לא רק צלחות הקפאת לפני ניתוח לפתור את הבעיה, אבל זה חיוני גם בהקשר של תפוקה גבוהה כמו ניתוחים, עם פרוטוקול הנוכחית סטנדרטיים נוזלי טיפול רובוטים, 2 אנשים יכולים בקלות לעבד עד 50 צלחות בשבוע. נכון לעכשיו, יש מסך שגרתי 30 צלחות בשבוע, מה שמאפשר המסך הגנום כולולהתנהל פעם אחת פחות מ 2 חודשים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אחת התכונות המעניינות של פרוטוקול זה היא העובדה כי היא משתמשת אגר מוצק, מה שמאפשר מבחני שלא ניתן לבצע התרבות נוזלי. כמו תולעת הפיזיולוגיה משתנה בהתאם לתנאים תרבות<sup&gt; 20,21</sup&gt;, להיות מסוגל לבצע מבחני על מצע מוצק יכול גם להשלים הרגילים נוזל מבוססי מסכי. עבור פנוטיפים מסוימים (תנועה למשל), הניתוח יכול להתבצע ישירות עם 96-גם מוצקים צלחות בינוניות. על המסך הנוכחי, עם זאת, כפי Biosort לא יכול לטעום מהצלחות בינוניים מוצקים, תולעים מועברים 1 לנוזל לפני ההקפאה. מצד שני, Biosort COPAS מאפשר ניתוח כמותי multiparametric תואמת המדידה של פנוטיפים שונים. סביר להניח כי עבור מסך נתון לא כל הפרמטרים הנמדדים יהיה העיקרית לקריאה החוצה. עם זאת, מדידות אלה יכול להיות שימושי עבור כמה סיבות. הם מאפשרים 1 כדי לקבוע אם assay רץ כראוי. לדוגמה, אפשר לבדוק את המספר ואת הגודל של התולעים היטב כל אחד מהם. רק כאשר שיבוט RNAi צריך לחסום את הצמיחה או רבייה צריך להיות סטייה מהערכים הצפויים. וולס עם פחות מ -20 תולעים ו / או בעלי חיים קטנים יותר (30% TOF) לעומת סטןגודארד שליטה ללא השפעה על הצמיחה (<em&gt; למשל GFP (RNAi</em&gt;)) ניתן לשלול מן הניתוחים הבאים. פונקציה של שיבוטים אלו ניתן לטפל באמצעות פרוטוקול חלופי שבו תולעים נחשפים לחיידקים RNAi אחרי ההתפתחות שלהם היא מתקדמת היטב<sup&gt; 15</sup&gt;. הפרמטרים השונים יכול לשמש גם כדי לחדד את הגן המועמד (HIT) הבחירה, למשל, הגבלת להיטים רק לאלה המשפיעים פלואורסצנטי ירוק, אבל לא אדום. השיטה המדויקת נבחר לבחירת להיטים יהיה תלוי בסוג המסך המדויק לקריאה החוצה. נוכח המורכבות של הנתונים המופקים מן המסך הגנום כולו כמותית, בשיתוף עם סטטיסטיקאי ייתכן שיהיה צורך.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; פרוטוקול אנו מתארים ניתן להתאים בקלות סוגים אחרים של מבחני. לדוגמה, בשלב הזיהום<em&gt; ד coniospora</em&gt; יכול להיות מוחלף על ידי פתוגן אחר מסוגל להדביק על התקשורת מוצקים. זה שימושי באופן פוטנציאלי שכן מצאנו כי רבים מהגורמים החשובים ארסיות על זיהום marcescens Serratia בתרבות נוזל לא משחק תפקיד במהלך ההדבקה על מצע מוצק (א &#39;Pradel, תקשורת אישית). הפרוטוקול הוא גם תואם באופן מלא עם בדיקות של תרכובות כימיקלים<sup&gt; 22-24</sup&gt;, או לזהות תרכובות עם bioactivity שימוש בספריות שונות של חיידקים<sup&gt; 25</sup&gt;, אז צריך למצוא את השירות כללי<em&gt; ג elegans</em&gt; קהילת המחקר.</p

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD ניתוח מערכות </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD ניתוח מערכות </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> דבק AeraSeal הסרט </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> איזופרופיל β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 צלחת באר עמוקה </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 גם צלחת שטוחה </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 צלחת עגולה גם </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> כל הספק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נץקאן רובוט </td><td> נץקאן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> האיחוד Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

התערבות RNA היא שיטה רבת עוצמה כדי להבין תפקוד הגן, במיוחד כאשר נערך בקנה מידה כל הגנום, ובהקשר כמותית. ב C. elegans, תפקוד הגן ניתן הפילו בפשטות וביעילות על ידי האכלה עם תולעים חיידקים המבטאים dsRNA המתאים גן ספציפי 1. תוך יצירת ספריות של שיבוטים RNAi מכסה את רוב ג elegans הגנום 2,3 פתחה את הדרך האמיתיים מחקרים גנומית פונקציונלית (ראה למשל 4-7), רוב השיטות מבוססות הן מייגע. מוי ועמיתיו פיתחו חצי אוטומטיות פרוטוקולים המאפשרים הגנום כולו מסכים 8. הגישה מתבססת על הדמיה מיקרוסקופית וניתוח התמונה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול חלופי המסך הגנום כולו תפוקה גבוהה, המבוססת על טיפול הרובוטית של חיידקי RNAi שיבוטים, ניתוח כמותי באמצעות Biosort COPAS (האיחוד Biometrica (UBI)), ותוכנה משולבת: MBioLIMS (ניהול מעבדה מערכת מידע מ Modul-Bio) טכנולוגיה המספקת תפוקה מוגברת על ניהול נתונים ומעקב אחר המדגם. השיטה מאפשרת מסכי להתנהל על צלחות בינוניים מוצקים. הדבר חשוב במיוחד עבור כמה מחקרים, כגון אלו בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות פונה ב C. elegans, מאז חיידקים מסוימים לא יעיל להדביק תולעים בתרבות נוזל. אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה כדי לכמת את החשיבות של גנים חסינות אנטי פטרייתי מולד ב C. elegans. במקרה זה, הגישה מתבססת על שימוש זן מהונדס נושאת גן אפידרמיס זיהום מושרה כתב ניאון, עם GFP בשליטת היזם של מיקרוביאלית פפטיד גן NLP 29 ו לכתב ניאון אדום בא לידי ביטוי ב constitutively האפידרמיס. זה האחרון מספק בקרה פנימית על שלמות תפקודית של האפידרמיסו transgene ספציפי להשתיק 9. כאשר התולעים בקרה נגועים על ידי הפטרייה הם לזרוח בירוק. דריסה על ידי RNAi גן נדרש-NLP 29 תוצאות הביטוי של הקרינה פחתה לאחר ההדבקה. נכון לעכשיו, פרוטוקול זה מאפשר יותר מ -3,000 שיבוטים RNAi להיבדק וניתח בשבוע, לפתוח את האפשרות של הקרנת הגנום כולו בתוך פחות מ 2 חודשים.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול<em&gt; ג elegans</em&gt; וספריות RNAi האכלה המאפשר מדידה אוטומטית של מספר פרמטרים כגון גודל, הקרינה ואת האטימות של תולעים בודדים באוכלוסייה. אנחנו נותנים דוגמה אחת של המסך כדי לזהות גנים המעורבים חסינות אנטי פטרייתי מולדת ב<em&gt; ג elegans</em&gt;.

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...