Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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Ringraziamo D. Braendle, CL Kurz e F. Montañana-Sanchis per i loro contributi. Questo progetto è stato sostenuto anche da finanziamenti della ANR e il Conseil Régional PACA e finanziamenti istituzionali da INSERM e il CNRS.

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Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

Il laboratorio collabora con l&#39;Unione Ewbank Biometrica e Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; L&#39;attuale protocollo consente su larga scala di screening RNAi in<em&gt; C. elegans</em&gt; Su supporti solidi, utilizzando il livello di espressione di un gene reporter fluorescente come lettura-out. È stato ottimizzato con strumenti automatizzati per facilitare high-throughput saggi, permettendo maneggevolezza e veloce di un gran numero di campioni, in modo efficiente, affidabile e riproducibile. Altri metodi sono stati descritti, che non si basano così pesantemente sulla gestione automatizzata del campione di liquido<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un aspetto fondamentale organizzativo al protocollo è stato lo sviluppo di un metodo affidabile di monitoraggio campione adattando il software commerciale MBioLIMS alla procedura schermo RNAi in collaborazione con la ModulBio azienda. In ogni fase della procedura, le piastre sono ora identificati da codici a barre generati all&#39;interno del LIMS. Come LIMS registra anche l&#39;identità dei cloni in ogni pozzetto su ciascuna piastra, andando da pozzetto a gene putativo è semplice. E di là di questo, i collegamenti LIMS per la WormBase banca dati comunitaria, consentendo l&#39;accesso diretto ai dati molecolari e funzionali in merito a qualsiasi dato gene. Il LIMS facilita anche le analisi da effettuare sul piatto o addirittura a livello dei cromosomi e intero genoma. Per queste analisi, i dati vengono memorizzati in un modo che è perfettamente compatibile con utensili precedentemente descritti come COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un punto critico nel metodo sperimentale è la regolazione della quantità di cibo in relazione al numero di vermi. Per molti saggi, è essenziale che i vermi non fame alla fine dell&#39;esperimento, ma è anche importante non avere troppo cibo all&#39;inizio. Abbiamo osservato che un&#39;alta densità di cibo riduce induzione fluorescenza nel protocollo utilizzando vermi trasportano il p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: Reporter GFP. Questo può riflettere una diminuita efficienza infezione quando i vermi vengono coltivate nei batteri troppo (BS, risultati non pubblicati). Allo stesso tempo, le condizioni di coltura del batterio RNAi è anche importante, poiché questo determina se dsRNA viene prodotta ad un livello ottimale. Alcuni protocolli per la grande RNAi richiedono cultura di cloni RNAi su piastre di agar prima di semina colture liquide<sup&gt; 8</sup&gt;. Abbiamo ottenuto il silenziamento genico robusta omissione di questo passaggio. Abbiamo optato per la coltivazione di un eccesso di ogni cultura per garantire risultati omogenei. Il protocollo descritto, infatti, fornisce materiale sufficiente per condurre 2 o 3 schermi in parallelo. Nell&#39;interesse di ottenere i risultati più robusti, siamo favorevoli, però, conducendo schermi in duplicato utilizzando culture indipendenti di vermi, batteri e spore fungine RNAi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un altro passo fondamentale è legato all&#39;utilizzo di mezzo che non è né troppo umido né troppo secco. Se le piastre non sono asciutti a sufficienza, i batteri RNAi non asciugare bene e vermi nuotare durante il saggio. Ciò può causare problemi. Ad esempio, i worm non sono efficacemente infettati da<em&gt; D. coniospora</em&gt; In un liquido (C. Couillault, risultati non pubblicati). D&#39;altra parte, in lastre secche, l&#39;osmolarità del aumenti medi di coltura. Ciò ha effetti diretti sulla fisiologia a vite senza fine<sup&gt; 17</sup&gt;, Compresa l&#39;induzione di alcuni geni peptidi antimicrobici, come ad esempio<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Il volume utilizzato per erogare i vermi e spore è fondamentale per l&#39;essiccazione efficaci e rapidi. Se più di 10 pl di liquido viene aggiunta alle piastre fresche, i pozzetti può richiedere molte ore per asciugare. Ciò può significare che è difficile da usare metodi robotici per aggiungere vermi alle piastre. Ad esempio, ogni vite senza fine viene erogato dalla Biosort in circa 1 ml di liquido. Al momento distribuire i vermi manualmente che ci permette anche di superare la tendenza di vermi in soluzione a sedimentare.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Abbiamo già segnalato un adeguamento del Biosort che ha permesso uno piastra a 96 pozzetti da analizzare in 36 minuti<sup&gt; 19</sup&gt;. La macchina fabbricante UBI offre una modifica del Biosort per ridurre ulteriormente il tempo di analisi. Con il &quot;FastReFlex&quot;, i campioni vengono indirizzate direttamente attraverso la cella di flusso per l&#39;analisi, bypassando la bolla-trappola filtro. Ciò comporta una riduzione significativa del tempo di acquisizione dati; una piastra intero può essere analizzata in 22 min consentendo circa 20 piastre da trattare al giorno. Se i pannelli non sono state congelate, tuttavia, ci sarebbe un intervallo 8 ore tra i primi e gli ultimi. Data la durata relativamente breve dell&#39;esperimento, con l&#39;infezione dura solo 18 ore, ciò introduce una variabile inaccettabile in piastre. Non solo piastre di congelamento prima dell&#39;analisi risolvere questo problema, ma è anche essenziale nel contesto di high-throughput di analisi che, con l&#39;attuale protocollo e il liquido standard di gestione dei robot, 2 le persone possono facilmente elaborare fino a 50 piastre una settimana. Attualmente, abbiamo regolarmente schermo 30 piastre una settimana, che permette uno schermo intero genomada effettuare una volta in meno di 2 mesi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Una caratteristica interessante di questo protocollo è il fatto che essa utilizza agar solido, permettendo dosaggi che non possono essere eseguite in coltura liquida. Come fisiologia verme differisce a seconda delle condizioni di coltura<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Essendo in grado di eseguire saggi su supporto solido può anche integrare usuali base liquida schermi. Per alcuni fenotipi movimento (ad esempio), l&#39;analisi può essere effettuata direttamente con 96-well solidi piastre di terreno. Per la schermata corrente, tuttavia, come il Biosort non può campionare da piastre di terreno solido, i vermi vengono prima trasferiti a liquido prima del congelamento. D&#39;altra parte, il Biosort COPAS consente un&#39;analisi multiparametrica quantitativa compatibile con la misurazione di molti diversi fenotipi. È probabile che per ogni dato schermo non tutti i parametri misurati sarà la lettura primaria out. Tuttavia, queste misurazioni possono essere utili per varie ragioni. Essi permettono di determinare se il saggio eseguito correttamente. Ad esempio, si può controllare il numero e la dimensione dei vermi in ciascun pozzetto. Solo quando un clone RNAi dovrebbe bloccare la crescita o la riproduzione dovrebbe esserci uno scostamento dai valori attesi. Wells con meno di 20 vermi o / e degli animali del 30% più piccoli (TOF) rispetto ad una standarddard di controllo con nessun effetto sulla crescita (<em&gt; Ad esempio, GFP (RNAi</em&gt;)) Può essere escluso dal analisi successive. La funzione di questi cloni possono essere identificati utilizzando un protocollo alternativo in cui i vermi sono esposti ai batteri RNAi dopo il loro sviluppo è in fase avanzata<sup&gt; 15</sup&gt;. I vari parametri possono anche essere utilizzati per perfezionare gene candidato (hit) selezione, per esempio, limitando riscontro solo a quelle che influiscono fluorescenza verde, ma non rosso. Il metodo preciso prescelte per la selezione riscontro dipenderà dal tipo di schermo e la sua esatta lettura-out. Data la complessità dei dati generati da un punto di genome-wide screen, la collaborazione con un esperto di statistica può essere richiesta.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Il protocollo che descriviamo può essere facilmente adattato ad altri tipi di saggi. Ad esempio, al passo infezione<em&gt; D. coniospora</em&gt; Potrebbe essere sostituita da qualsiasi altro agente patogeno in grado di infettare su supporti solidi. Questo è potenzialmente utile che abbiamo trovato che molti dei fattori di virulenza importanti per l&#39;infezione da Serratia marcescens in coltura liquida non svolgono un ruolo durante l&#39;infezione su terreno solido (E. Pradel, comunicazione personale). Il protocollo è inoltre pienamente compatibile con i test di composti chimici<sup&gt; 22-24</sup&gt;, O per identificare composti con attività biologica utilizzando diverse librerie di batteri<sup&gt; 25</sup&gt;, Quindi dovrebbe trovare un programma di utilità generale nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Comunità di ricerca.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellicola adesiva AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropil β-D-tiogalattopiranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Piastra da 96 pozzi profondi </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra a 96 pozzetti piatta </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra a 96 pozzetti rotonda </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robot </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Union Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA interferenza è un potente metodo per capire la funzione dei geni, soprattutto se condotta in un intero genoma scala e in un contesto quantitativo. In C. elegans, la funzione del gene può essere abbattuto modo semplice ed efficiente da mangiare vermi con i batteri che esprimono un dsRNA corrispondente a un gene specifico 1. Mentre la creazione di librerie di cloni RNAi che copre la maggior parte del C. elegans genoma 2,3 aperto la strada a veri e propri studi di genomica funzionale (vedi per esempio 4-7), la maggior parte dei metodi stabiliti sono laboriosi. Moy e colleghi hanno sviluppato protocolli semi-automatici che facilitano la genome-wide schermi 8. L&#39;approccio si basa su immagini microscopiche e analisi delle immagini. Qui si descrive un protocollo alternativo per un alto throughput genoma schermo, sulla base del manipolatore batterica cloni RNAi, analisi quantitativa utilizzando la Biosort COPAS (Union Biometrica (UBI)), e unosoftware integrato: il MBioLIMS (Laboratory Information System della Direzione di Modul-Bio), una tecnologia che offre un throughput maggiore per la gestione dei dati e tracciabilità del campione. Il metodo consente di schermi essere realizzato su piastre di terreno solido. Ciò è particolarmente importante per alcuni studi, come quelli riguardanti le interazioni ospite-patogeno in C. elegans, dal momento che alcuni microbi non si infettano in modo efficiente i vermi in coltura liquida. Si mostrano come il metodo può essere utilizzato per quantificare l&#39;importanza di geni anti-fungini immunità innata in C. elegans. In questo caso, l&#39;approccio si basa sull&#39;utilizzo di un ceppo transgenica che trasporta un epidermica un&#39;infezione-inducibile gene fluorescente reporter, con GFP sotto il controllo del promotore del gene NLP peptide antimicrobico 29 e un reporter fluorescente rossa che si esprime costitutivamente nella epidermide. Quest&#39;ultimo fornisce un controllo interno per l&#39;integrità funzionale dell&#39;epidermidetransgene e aspecifica tacere 9. Quando i vermi di controllo sono infettate dal fungo che fluorescenza verde. Abbattere da RNAi un gene necessario per nlp 29 risultati di espressione a fluorescenza diminuita dopo l&#39;infezione. Attualmente, questo protocollo permette di oltre 3.000 cloni RNAi per essere testato e analizzato a settimana, aprendo la possibilità di screening dell&#39;intero genoma in meno di 2 mesi.

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Descriviamo un protocollo usando<em&gt; C. elegans</em&gt; E librerie di alimentazione RNAi che permette la misurazione automatica dei molteplici parametri come la fluorescenza, le dimensioni e l&#39;opacità dei vermi individuali in una popolazione. Diamo un esempio di uno schermo per identificare i geni coinvolti in anti-fungine immunità innata<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...