Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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우리는 그들의 공헌에 대해 D. Braendle, CL Kurz와 F. Montañana-Sanchis 감사드립니다. 이 프로젝트 ANR과 Conseil 지역 PACA와 INSERM과 CNRS의 기관 자금 지원에서 교부금에 의해 지원되었다.

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Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

Ewbank 연구실 연합 Biometrica 및 Modul-바이오와 협력.

<p class="jove_content"&gt; 현재의 프로토콜은 대규모 RNAi 심사에 허용<em&gt; C. elegans</em&gt; 형광 리포터 유전자의 표현의 수준을 같이 읽고 아웃 이용한 고체 매체에. 그것은, 효율적인 신뢰성과 재현성 방식으로, 샘플 다수의 쉽고 빠른 처리를 허용하는 높은 처리량 assays를 촉진하기 위해 자동화된 도구에 최적화되었습니다. 다른 방법은 자동화된 액체 시료 처리에 너무 크게 의존하지 않는 것이 설명되었습니다<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 프로토콜에 대한 하나의 중요한 조직 양상은 회사 ModulBio와 협력 RNAi 화면 프로 시저로 상용 MBioLIMS 소프트웨어를 채택하여 샘플 추적의 강력한 방법의 개발되었습니다. 절차의 모든 단계에서, 접시는 이제 LIMS 내에 생성된 바코드에 의해 식별됩니다. LIMS는 또한 각각의 접시에 각각 우물에 클론의 신원을 기록으로 우물에서 putative 유전자에가는 것은 간단합니다. 그리고이 넘어, 커뮤니티 데이터베이스 WormBase에 LIMS 링크는 특정 유전자에 대한 분자 및 기능적 데이터에 직접 액세스할 수 있도록합니다. LIMS는 분석이 판 또는 염색체와 전체를 게놈 수준에서 실시하기 용이하게합니다. 이러한 분석은 데이터 등 COPAmulti와 같은 이전에 설명된 도구와 완전히 호환되는 방식으로 저장됩니다<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 메서드에 하나의 중요한 실험적 포인트는 벌레의 숫자에 상대적인 음식의 수량의 조정이다. 많은 assays 들어, 웜은 실험 끝에 굶어하지 않는 것이 중요하지만 그것은 시작에 너무 많은 음식을 필요하지 않는 것도 중요합니다. 우리는 음식의 높은 밀도는 P를 옮기는 ​​벌레를 사용하여 프로토콜에 형광 유도를 감소 것을 관찰했습니다<em&gt; nlp-29</em&gt; :: GFP 기자. 벌레가 (학사되지 않은 결과) 너무 많은 박테리아에서 배양해 때이 줄었 감염 효율이 반영됩니다. 이 dsRNA가 최적의 수준에서 생산 여부를 결정 이후 동시에 RNAi 박테리아의 문화 조건도 중요합니다. 대규모 RNAi에 대한 몇 가지 프로토콜은 액체 배양을 퍼뜨리고하기 전에 한천 플레이트에 RNAi 클론의 문화를 필요로<sup&gt; 8</sup&gt;. 우리는이 단계를 생략 강력한 유전자 입을를 취득. 우리는 동질적인 결과를 보장하기 위해 각 문화의 과잉 성장을위한하기로했다. 사실에서 설명한 프로토콜은 병렬로 2 개 또는 3 개의 화면을 수행할 수 있도록 충분한 자료를 제공합니다. 가장 강력한 결과를 얻기의 관심에서 우리의 스크린을 실시하지만, 선호 웜, RNAi 박테리아 및 곰팡이 포자의 독립적인 문화를 사용하여 중복.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 또 다른 중요한 단계는 너무 습해도 너무 건조하지도 매체를 사용하는 것에 관련이있다. 접시가 충분히 건조되지 않으면 RNAi 박테리아가 제대로 건조되지 않고 웜은 분석 중에 수영 것입니다. 이것은 문제가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 웜이 효과적으로 감염되지 않습니다<em&gt; 디 coniospora</em&gt; 액체의 (C. Couillault, 게시되지 않은 결과). 한편, 건조 접시에 배지 증가 osmolarity. 이것은 웜 생리 기능에 직접적인 영향을 가지고<sup&gt; 17</sup&gt;, 등 일부 항균 펩타이드 유전자의 유도를 포함<em&gt; nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. 웜 및 포자를 분배하는 데 사용되는 볼륨은 효과적이고 신속한 건조를 허용하는 것이 중요합니다. 액체 중 10 개 이상 μL가 신선한 접시에 추가되면, 우물은 건조 많은 시간이 걸릴 수 있습니다. 이것은 접시에 벌레를 추가하는 로봇 방법을 사용하기 어렵다는 것을 의미합니다. 예를 들어, 각각의 벌레는 액체의 주위에 1 μL의 Biosort에 의해 적절합니다. 그것은 또한 우리가 침전에 대한 솔루션 웜의 경향을 극복할 수있는대로 저희는 현재 수동으로 벌레를 배포합니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 이전에 한 96 - 웰 플레이트가 36분에서 분석을 할 수 있도록 Biosort의 조정보고<sup&gt; 19</sup&gt;. 기계 제조 업체 유비는 이제 더 이상 분석 시간을 줄일 수있는 Biosort의 수정을 제공합니다. &quot;FastReFlex&quot;로 샘플을 직접 버블 트랩 필터를 거치지 않고 분석을위한 흐름 전지를 통해 라우트됩니다. 데이터 수집을위한 시간을 크게 감소의이 결과는, 전체 플레이트가 하루에 치료할 수 있도록 20 접시 주위에있게 22 분 안에 분석할 수 있습니다. 접시는 냉동하지 않은 경우 단, 처음이자 마지막 사람 사이의 8 시간 간격이있을 것입니다. 단지 18 시간 지속되는 감염 실험의 비교적 짧은 기간을 감안할 때, 이것은 번호판에 걸쳐 허용되지 않는 변수를 소개합니다. 냉동 번호판은이 문제를 해결 분석을 이전하지,하지만, 2 사람이 쉽게 50 접시 주일까지 처리할 수있는 현재의 프로토콜 및 표준 액체 처리 로봇과로 그것은 또한 높은 처리량 분석의 맥락에서 중요하다뿐만 아니라. 현재 우리가 일상적으로 화면을 30 접시 주 전체를 게놈 스크린에게 있습니다이하보다 2 개월 만에 한 번 실시합니다.</p&gt;<p class="jove_content"이 프로토콜의&gt; 하나 재미있는 기능은 액체 문화에서 수행할 수없는 assays 수 있도록, 고체 한천을 사용한다는 사실입니다. 웜 생리학은 문화 조건에 따라 다릅니다로서<sup&gt; 20,21</sup&gt;, 고체 배지에 assays는 또한 일반적인 액체 기반의 화면을 보완 수행할 수있는. 특정 phenotypes (예 : 운동) 내용 분석 96 - 웰 고체 배지 플레이트와 직접 진행하실 수 있습니다. 현재 화면의 경우 그러나, Biosort으로 고체 배지 플레이트에서 맛볼 수없는, 웜 먼저 동결되기 전에 액체로 전송됩니다. 한편, COPAS Biosort는 여러 phenotypes의 측정과 호환 multiparametric 정량 분석​​이 이루어질 수 있습니다. 그것은 특정 화면에 대한 모든 측정 매개 변수가 기본 읽기있을 가능성이 높습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 측정치는 여러 가지 이유로 유용할 수 있습니다. 그들은 하나가 검정이 올바르게 실행 여부를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 각 우물에 벌레의 숫자와 크기를 확인하실 수 있습니다. RNAi의 클론 성장 또는 복제를 차단해야만이 곳 예상 값의 편차가 있어야합니다. 20 명 미만 웜 또는 / 30 % 더 작은 동물 (TOF)와 웰스 스탄에 비해dard 성장에 취지만 제어 (<em&gt; 예 GFP (RNAi</em&gt;))는 이후 분석에서 제외시킬 수 있습니다. 그들의 개발은 물론 고급 후 이러한 클론 기능은 웜은 RNAi 세균에 노출되는 어떤 점에서 다른 프로토콜을 사용하여 해결할 수<sup&gt; 15</sup&gt;. 다른 매개 변수는 오직 녹색 형광지만 빨간색이 아니라 영향을 미치는 사람을 히트곡을 제한, 예를 들어 후보 유전자 (조회수)을 선택, 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 안타를 선택 선택한 정확한 방법은 화면의 종류와 정확한 읽기 아웃에 따라 달라집니다. 양적 게놈 - 와이드 스크린에서 생성된 데이터의 복잡성을 감안할 때, 통계와의 협력이 필요할 수 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리가 설명하는 프로토콜은 쉽게 assays 다른 유형의 적응하실 수 있습니다. 예를 들어, 감염 단계에서<em&gt; 디 coniospora</em&gt; 고체 미디어에 감염될 수있는 다른 병원균에 의해 대체될 수 있습니다. 우리가 액체 문화 Serratia marcescens 감염에 중요한 독성 요소의 많은 고체 매체 (E. Pradel, 개인 통신)에 감염하는 동안 역할을하지 않는 것으로 나타났습니다로서 이것은 잠재적으로 유용합니다. 프로토콜은 또한 화학 화합물의 시험과 완벽하게 호환<sup&gt; 22-24</sup&gt; 또는 박테리아의 다른 라이브러리를 사용 bioactivity와 화합물을 식별하는 방법<sup&gt; 25</sup&gt; 그래서의 일반 유틸리티를 발견해야<em&gt; C. elegans</em&gt; 연구 커뮤니티입니다.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD 진단 시스템 </td><td> 214,010 </td><td></td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD 진단 시스템 </td><td> 211,677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal 접착 필름 </td><td> Dutscher </td><td> 760,214 </td><td></td></tr><tr><td> 이소 프로필 β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> 써모 과학 </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 깊은 우물을 판 </td><td> 써모 과학 </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 잘 플랫 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 353,072 </td><td></td></tr><tr><td> 96도 회전 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 353,077 </td><td></td></tr><tr><td> 테트라 싸이클린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN 로봇 </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> 비가 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> 연합 Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul - 바이오 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA 간섭은 전체를 게놈 규모와 양적 맥락에서 실시한 특히 유전자 기능을 이해하는 강력한 방법입니다. C로 elegans은 유전자 기능은 특정 유전자 하나에 해당하는 dsRNA을 표현 세균과 벌레를 먹이로 간단하고 효율적으로 무너뜨렸다 수 있습니다. RNAi의 클론의 라이브러리의 생성 C.의 대부분을 커버하면서 elegans 게놈 2,3 진정한 기능적 게놈 연구 (예 : 4-7에 대한 참조)를 위해 길을 열었습니다, 대부분의 설립 방법 힘드는 있습니다. Moy와 동료들은 게놈 - 와이드 스크린에게 8을 용이하게 세미 자동화된 프로토콜을 개발했습니다. 접근 방식은 미세한 이미징 및 이미지 분석에 의존합니다. 여기서 우리는 대안 세균성 RNAi 클론, COPAS Biosort (연합 Biometrica (유비)을)를 사용하여 정량 분석​​의 로봇 핸들링을 바탕으로 높은 처리량 게놈 - 와이드 스크린을위한 프로토콜, 그리고을 설명통합 소프트웨어 : MBioLIMS (Modul-바이오의 실험실 정보 관리 시스템) 데이터 관리 및 샘플 추적을위한 향상된 처리량을 제공하는 기술입니다. 방법은 화면이 고체 배지 플레이트에 실시 할 수 있습니다. 이것은 C.에 해당 주소 호스트 병원체 상호 작용과 같은 몇 가지 연구를 위해 특히 중요 elegans, 특정 미생물을 효율적 액체 문화 웜 감염되지 않습니다 때문입니다. 우리는 메서드가 C.의 안티 - 에게선 타고난 면역에 유전자의 중요성을 계량하는 데 사용할 수있는 방법을 보여 elegans. 이 경우, 접근 방식에 constitutively 표현된다 항균 펩타이드 유전자 nlp 29 발기인과 빨간색 형광 기자의 통제하에 GFP으로 표피 감염-inducible 형광 리포터 유전자를 나르는 유전자 변형 변형의 사용에 의존 표피. 후자는 표피의 기능 무결성을위한 내부 통제를 제공그리고 특이 현상 transgene은 9 입을. 제어 웜은 균류에 감염되면 그들은 녹색 형광. RNAi 감염 후 감소된 형광의 nlp 29 표현 결과에 필요한 유전자에 의해 아래로 들렸습니다. 현재이 프로토콜은 3,000 명이 넘는 RNAi의 클론이 덜보다 2 개월 만에 전체 게놈을 분석해의 가능성을 열어, 주당 테스트 및 분석 수 있습니다.

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

우리가 사용하는 프로토콜을 설명<em&gt; C. elegans</em이러한 형광, 크기와 인구에서 개별 웜의 투명도 등 여러 매개 변수의 자동 측정을 허용&gt;과 RNAi 먹이 라이브러리. 우리의 안티 - 에게선 타고난 면역에 관여 유전자를 식별하는 화면 중 하나를 예를 들면요<em&gt; C. elegans</em&gt;.

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

연구

생물학

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

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에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...