Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Vi takker D. Braendle, CL Kurz og F. Montañana-Sanchis for deres bidrag. Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra ANR og Conseil Regional PACA, og institusjonell støtte fra INSERM og CNRS.

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li><li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li><li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting.">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li><li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes.">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li><li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+high-throughput+screens:+the+C+elegans+model.">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1551-8507 (2006).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M., Ewbank, J., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+Infection+by+Bacterial+and+Fungal+Pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens.</a> Methods Mol Biol. 415, 403-427 (2008).</li><li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNP-1/ATR-X+acts+with+RB,+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans.">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions.">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li><li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li><li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data.">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li><li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans.">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li><li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20&#47;GCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis.">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20&#47;GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li><li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome.">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+a+dish:+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis.">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li><li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay.">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li><li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2.">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

Den Ewbank lab samarbeider med Union Biometrica og Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; Den aktuelle protokollen lar storstilt RNAi screening i<em&gt; C. elegans</em&gt; På faste medier, ved hjelp av nivået av uttrykk for en fluorescerende reporter gen som en leser-out. Det har blitt optimalisert med automatiserte verktøy for å forenkle high-throughput analyser, noe som gir enkel og rask håndtering av store antall prøver, på en effektiv, pålitelig og reproduserbar måte. Andre metoder har blitt beskrevet som ikke stole så mye på automatisert flytende prøvehåndtering<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En viktig organisatorisk aspekt til protokollen har vært utviklingen av en robust metode for prøven sporing ved å tilpasse den kommersielle MBioLIMS programvare til RNAi skjermen prosedyren i samarbeid med selskapet ModulBio. På hvert trinn i prosedyren, blir platene nå identifisert ved strekkoder som genereres innenfor LIMS. Som LIMS også registrerer identiteten til de kloner i hver brønn på hver plate, går fra bra til utlagde genet er enkel. Og utover dette, LIMS lenker til samfunnet databasen WormBase og gir direkte tilgang til molekylære og funksjonelle data om en gitt gen. LIMS forenkler også analyser som skal gjennomføres på tallerkenen eller kromosom og hel-genom nivå. For disse analysene, lagres dataene på en måte som er helt kompatibel med tidligere beskrevet verktøy som COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En kritisk eksperimentelt punkt i metoden er justering av mengden av mat i forhold til antall ormer. For mange analyser, er det viktig at ormer ikke sulte på slutten av forsøket, men det er også viktig å ikke ha for mye mat i starten. Vi har observert at en høy tetthet av mat reduserer fluorescens induksjon i protokollen ved hjelp av ormer som bærer p<em&gt; NLP-29</em&gt; :: GFP reporter. Dette kan reflektere en redusert infeksjon effektivitet når ormer dyrkes i for mye bakterier (BS, upubliserte resultater). Samtidig, er kulturen forholdene i RNAi bakterier også viktig, da dette avgjør om dsRNA er produsert på et optimalt nivå. Noen protokoller for storskala RNAi krever kultur for RNAi kloner på agar plater før såing flytende kulturer<sup&gt; 8</sup&gt;. Vi fikk robust genet Silencing utelate dette trinnet. Vi valgte voksende overskudd av hver kultur for å sikre homogene resultater. Protokollen er beskrevet i faktum gir tilstrekkelig materiale til å gjennomføre 2 eller 3 skjermer i parallell. I interesse av å få de mest robuste resultatene, favoriserer vi imidlertid gjennomføre skjermer i to eksemplarer med selvstendige kulturer av ormer, RNAi bakterier og soppsporer.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Et annet kritisk punkt er knyttet til bruk av medium som verken er for fuktig eller for tørt. Hvis platene ikke er tørre nok, vil ikke RNAi bakterier ikke tørke ordentlig og ormer vil svømme under analysen. Dette kan føre til problemer. For eksempel ormer ikke effektivt smittet av<em&gt; D. coniospora</em&gt; I væske (C. Couillault, upubliserte resultater). På den annen side, i tørre plater, osmolariteten av kultur medium øker. Dette har direkte effekter på mark fysiologi<sup&gt; 17</sup&gt;, Inkludert induksjon av enkelte antimikrobielle peptid gener, for eksempel<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Volumet som brukes til å dispensere ormer og sporer er kritisk til at effektive og rask tørking. Hvis mer enn 10 mL av væske tilsettes ferske plater, kan de brønnene ta mange timer å tørke. Dette kan bety at det er vanskelig å bruke robot metoder for å legge ormer til platene. For eksempel er hver orm utlevert ved Biosort i ca 1 mL av væske. Vi har for tiden fordele ormer manuelt som at også tillater oss å overvinne tendensen av ormer i løsning sediment.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vi tidligere rapportert en justering av Biosort som tillot en 96-brønns plate som skal analyseres i 36 minutter<sup&gt; 19</sup&gt;. Maskinens produsent Ubi tilbyr nå en endring av Biosort å redusere ytterligere analysen tid. Med &quot;FastReFlex&quot;, blir prøvene direkte rutes gjennom strømningscellen for analyse, utenom boble-fellen filter. Dette resulterer i en betydelig reduksjon i tid for datainnsamlingen, en hel plate kan bli analysert i 22 min slik at rundt 20 plater som skal behandles per dag. Hvis platene ikke var frosset, derimot, ville det være en 8 timers intervall mellom første og siste de. Gitt den relativt korte varigheten av forsøket, med infeksjonen varer bare 18 timer, ville dette introdusere en uakseptabel variabel over platene. Ikke bare gjør frost plater før analyse løse dette problemet, men det er også viktig i forbindelse med high-throughput analyser som, med dagens protokollen og standard væske-håndtering roboter, kan 2 personer lett behandle opptil 50 plater i uken. Foreløpig har vi rutinemessig skjermen 30 plater i uken, noe som tillater en hel-genom skjermå bli gjennomført en gang på mindre enn 2 måneder.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Et interessant trekk ved denne protokollen er det faktum at den bruker fast agar, slik at analysene som ikke kan utføres i flytende kultur. Som orm fysiologi er forskjellig avhengig av kulturen vilkår<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Å kunne utføre analyser på fast medium kan også utfylle vanlige flytende-baserte skjermer. For enkelte fenotyper (f.eks bevegelse), kan analysen utføres direkte med 96-brønnen fast medium plater. For den aktuelle skjermen, men kan da Biosort ikke prøve fra fast medium plater, er ormer første overføres til væsken før frysing. På den annen side, tillater Copas Biosort en multiparametric kvantitativ analyse forenlig med måling av mange forskjellige fenotyper. Det er sannsynlig at for enhver skjerm ikke alle de målte parametrene vil være den primære lese-out. Likevel kan disse målingene være nyttig for flere grunner. De lar en å avgjøre hvorvidt analysen løp riktig. For eksempel kan man sjekke om antall og størrelse av ormer i hver brønn. Kun der en RNAi klone bør blokkere vekst eller reproduksjon bør det være et avvik fra den forventede verdier. Brønner med mindre enn 20 ormer og / eller dyr 30% mindre (TOF) sammenlignet med en standard kontroll med ingen effekt på vekst (<em&gt; F.eks GFP (RNAi</em&gt;)) Kan utelukkes fra påfølgende analyser. Funksjonen til disse klonene kan håndteres ved hjelp av en alternativ protokoll der ormer er utsatt for RNAi bakterier etter deres utvikling er vel avansert<sup&gt; 15</sup&gt;. De ulike parametrene kan også brukes til å avgrense kandidat genet (hit) utvalg, for eksempel begrense treff kun for de som påvirker grønn fluorescens, men ikke rødt. Den nøyaktige metoden som er valgt for å velge treff vil avhenge av type skjerm og dens eksakte lese-out. Gitt kompleksiteten av data generert fra en kvantitativ genom-wide skjerm, kan samarbeid med en statistiker være nødvendig.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Protokollen beskriver vi kan lett tilpasses andre typer analyser. For eksempel ved infeksjon trinn<em&gt; D. coniospora</em&gt; Kunne erstattes av noen annen patogen i stand til å infisere på faste medier. Dette er potensielt nyttig som vi har funnet ut at mange av de virulensfaktorer viktige for Serratia marcescens infeksjon i flytende kulturen ikke spille en rolle under infeksjonen på fast medium (E. Pradel, personlig kommunikasjon). Protokollen er også fullt kompatibelt med tester av kjemikalier forbindelser<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Eller identifisere forbindelser med bioaktivitet hjelp av ulike biblioteker av bakterier<sup&gt; 25</sup&gt;, Så skal finne en generell verktøyet i<em&gt; C. elegans</em&gt; Forskningsmiljø.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal selvklebende film </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 dyp brønn plate </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 godt flat plate </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 godt rund plate </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Enhver leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robot </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copas Biosort </td><td> Union Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA interferens er en kraftig metode for å forstå gen-funksjon, spesielt når gjennomført på en hel-genom skala og i en kvantitativ sammenheng. I C. elegans, kan gen-funksjon bli slått ned enkelt og effektivt ved å mate ormer med bakterier som uttrykker en dsRNA tilsvarende et bestemt gen 1. Mens etableringen av biblioteker av RNAi kloner dekker det meste av C. elegans genom 2,3 åpnet veien for ekte funksjonelle genom studier (se for eksempel 4-7), de fleste etablerte metoder er arbeidskrevende. Moy og kolleger har utviklet semi-automatiske protokoller som gjør genom-wide skjermer 8. Tilnærmingen bygger på mikroskopisk bildebehandling og bildeanalyse. Her beskriver vi en alternativ protokoll for en high-throughput genom-bredskjerm, basert på robot håndtering av bakteriell RNAi kloner, kvantitativ analyse ved hjelp av Copas Biosort (Union Biometrica (Ubi)), og enintegrert programvare: den MBioLIMS (Laboratory Information Management System fra Modul-Bio) en teknologi som gir økt gjennomstrømming for dataadministrasjon og prøve sporing. Metoden gjør at skjermene som skal utføres på fast medium plater. Dette er spesielt viktig for noen studier, for eksempel de adressering vert-patogen interaksjoner i C. elegans, siden visse mikrober ikke effektivt infisere ormer i flytende kultur. Vi viser hvordan metoden kan brukes til å kvantifisere betydningen av gener i anti-sopp medfødt immunitet i C. elegans. I dette tilfellet, stoler tilnærming på bruk av en transgen belastning bærer en epidermal infeksjon-induserbar fluorescerende reporter genet, med GFP under kontroll av arrangøren av den antimikrobielle peptid genet NLP 29 og en rød fluorescerende reporter som uttrykkes konstitutivt i epidermis. Sistnevnte gir en intern kontroll for den funksjonelle integritet i overhudenog uspesifikke transgenet stanse 9. Når kontroll ormer er infisert av soppen de fluoresce grønt. Banket ned av RNAi et gen som kreves for NLP 29 uttrykk gir redusert fluorescens etter smitte. Foreløpig lar denne protokollen mer enn 3000 RNAi kloner som skal testes og analyseres per uke, åpner muligheten for screening av hele genomet på mindre enn 2 måneder.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Vi beskriver en protokoll hjelp<em&gt; C. elegans</em&gt; Og RNAi fôring biblioteker som tillater automatisert måling av flere parametere som fluorescens, størrelse og tettheten av enkelte ormer i en populasjon. Vi gir ett eksempel på en skjerm for å identifisere gener involvert i anti-sopp medfødt immunitet i<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Kvantitative og Automated High-throughput Genome-wide RNAi skjermer i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysisk Kartlegging av kromosomer som bruker Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis analysen

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biokjemiske og høy gjennomstrømning mikroskopisk vurdering av fettmasse i<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...