Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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Agradecemos a D. Braendle, CL Kurz e F. Montañana-Sanchis por suas contribuições. Este projecto foi apoiado por doações da ANR e do Conseil Regional PACA e financiamento institucional de INSERM e do CNRS.

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O laboratório Ewbank colabora com União Biometrica e Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; O protocolo atual permite grande escala de rastreamento em RNAi<em&gt; C. elegans</em&gt; Em meios sólidos, usando o nível de expressão de um gene repórter fluorescente como uma leitura para fora. Tem sido optimizada com instrumentos automatizados para facilitar alto rendimento ensaios, permitindo a manipulação fácil e rápido de grandes números de amostras, de uma maneira eficiente, fiável e reproduzível. Outros métodos têm sido descritos, que não dependa tanto manipulação automatizada da amostra líquida<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Um aspecto chave organizacional para o protocolo tem sido o desenvolvimento de um método robusto de acompanhamento amostra através da adaptação do software MBioLIMS comercial para o procedimento de tela RNAi em colaboração com o ModulBio empresa. Em cada fase do processo, as placas são agora identificados por códigos de barras geradas dentro do LIMS. À medida que o LIMS também regista a identidade dos clones em cada poço em cada placa, indo de bem ao gene putativo é simples. E, além disso, os links LIMS para o banco de dados WormBase comunidade, permitindo o acesso direto aos dados moleculares e funcionais sobre qualquer gene. O LIMS também facilita a análise a ser realizada na placa ou mesmo a nível dos cromossomas e genoma. Para estas análises, os dados são armazenados de uma maneira que é inteiramente compatível com as ferramentas previamente descritos, tais como COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Um ponto crítico experimental no método é o ajustamento da quantidade de alimento em relação ao número de vermes. Para muitos ensaios, é essencial que os vermes não fome no final da experiência, mas também é importante não ter muita comida no início. Observou-se que uma densidade elevada de alimentos diminui a indução de fluorescência no protocolo usando vermes que transportam o p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: Repórter GFP. Isto pode reflectir uma eficiência de infecção diminuída quando os vermes são cultivadas em bactérias demasiado (BS, resultados não publicados). Ao mesmo tempo, as condições de cultura das bactérias RNAi também é importante, uma vez que este determina se ARNdc é produzido a um nível óptimo. Alguns protocolos para grande escala RNAi requerem cultura de RNAi clones em placas de ágar antes de semear culturas líquidas<sup&gt; 8</sup&gt;. Foram obtidos silenciamento do gene robusto omitindo este passo. Optou-se para o crescimento de um excesso de cada cultura para assegurar resultados homogéneos. O protocolo descrito no facto fornece material suficiente para conduzir 2 ou 3 telas em paralelo. No interesse de obter os resultados mais robustos, nós favorecemos, no entanto, a realização de telas em duplicata, utilizando culturas independentes de vermes, bactérias e esporos de fungos de RNAi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Outro passo crítico está relacionado ao uso de meio que não é nem muito úmido nem muito seco. Se as placas não são suficientemente seca, a bactéria RNAi não seca de forma adequada e vermes nadará durante o ensaio. Isto pode causar problemas. Por exemplo, os vermes não são eficientemente infectado por<em&gt; D. coniospora</em&gt; Em líquido (C. Couillault, resultados não publicados). Por outro lado, em placas secas, a osmolaridade dos aumentos de meio de cultura. Isso tem efeitos diretos sobre a fisiologia verme<sup&gt; 17</sup&gt;, Incluindo a indução de alguns genes de péptidos antimicrobianos, tais como<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. O volume utilizado para dispensar vermes e esporos é crítico para permitir a secagem eficaz e rápida. Se mais do que 10 uL de líquido é adicionada às placas frescas, os poços pode levar várias horas para secar. Isto pode significar que é difícil de utilizar métodos robóticos para adicionar vermes para as placas. Por exemplo, cada verme é dispensado pelo Biosort em cerca de 1 uL de líquido. Atualmente, distribuir os vermes manualmente, que também nos permite superar a tendência de vermes em solução de sedimentos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós anteriormente relatado um ajustamento do Biosort que permitiu uma placa de 96 poços a serem analisados ​​em 36 minutos<sup&gt; 19</sup&gt;. A máquina do fabricante UBI agora oferece uma modificação do Biosort diminuir ainda mais o tempo de análise. Com o &quot;FastReFlex&quot;, as amostras são encaminhadas diretamente através da célula de fluxo para análise, ignorando o filtro bolha armadilha. Isto resulta numa redução significativa no tempo de aquisição de dados; uma placa inteira pode ser analisado em 22 min, permitindo a cerca de 20 placas a ser tratado por dia. Se as placas não foram congeladas, no entanto, não haveria um intervalo de 8 horas entre os primeiros e últimos. Dada a duração relativamente curta do experimento, com a infecção dura apenas 18 horas, isso iria introduzir uma variável inaceitável em placas. Não só as placas de congelação antes da análise resolver este problema, mas também é essencial no contexto de alto rendimento como análises, com o protocolo padrão actual e líquido de tratamento de robôs, 2 pessoas podem facilmente processar um máximo de 50 placas de uma semana. Atualmente, nós rotineiramente tela de 30 placas por semana, o que permite uma tela de genoma inteiroa ser conduzida uma vez em menos de 2 meses.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Uma característica interessante deste protocolo é o facto de que ele usa agar sólido, permitindo que os ensaios que não podem ser realizados em cultura líquida. Como fisiologia verme difere dependendo das condições de cultura<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Sendo capaz de realizar ensaios em meio sólido pode também complementar habituais líquido à base de telas. Para certos fenótipos (por exemplo, movimento), a análise pode ser realizada directamente com placas de 96 poços em meio sólido. Para a tela atual, no entanto, como o Biosort não pode provar a partir de placas de meio sólido, worms são primeiro transferidos para líquido antes do congelamento. Por outro lado, o Biosort COPAS permite uma análise quantitativa multiparamétrico compatível com a medição de muitos diferentes fenótipos. É provável que para qualquer determinada tela nem todos os parâmetros medidos será o primário de leitura para fora. No entanto, estas medições podem ser úteis por várias razões. Eles permitem que um para determinar se o ensaio correu correctamente. Por exemplo, pode-se verificar o número e tamanho dos vermes em cada poço. Só quando um clone de RNAi deve bloquear o crescimento ou a reprodução deve haver um desvio dos valores esperados. Wells com menos de 20 vermes e / ou animais 30% menor (TOF) em comparação com um standard controle sem efeito sobre o crescimento (<em&gt; Por exemplo gfp (RNAi</em&gt;)) Pode ser excluída a partir de análises subsequentes. A função destes clones podem ser tratadas utilizando um protocolo alternativo, em que os vermes são expostos às bactérias RNAi após o seu desenvolvimento é bem avançado<sup&gt; 15</sup&gt;. Os parâmetros diferentes podem também ser utilizado para refinar gene candidato (batida) de selecção, por exemplo, limitando acessos apenas para os que afectam a fluorescência verde, mas não vermelho. O método preciso escolhido para a selecção acessos dependerá do tipo de tela e sua exacta de leitura para fora. Dada a complexidade dos dados gerados a partir de uma tela de todo o genoma quantitativa, a colaboração com um estatístico pode ser necessária.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; O protocolo descrevemos pode ser prontamente adaptado a outros tipos de ensaios. Por exemplo, na fase de infecção<em&gt; D. coniospora</em&gt; Poderia ser substituído por qualquer outro agente patogénico capaz de infectar em meios sólidos. Isto é potencialmente útil como nós descobrimos que muitos dos factores de virulência importantes para Serratia marcescens infecção em cultura líquida não desempenham um papel durante a infecção em meio sólido (E. Pradel, comunicação pessoal). O protocolo é também totalmente compatível com os testes de compostos químicos<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Ou para identificar compostos com bioactividade usando bibliotecas diferentes de bactérias<sup&gt; 25</sup&gt;, Então deve encontrar uma utilidade geral no<em&gt; C. elegans</em&gt; Comunidade de pesquisa.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Película adesiva AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropílico β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 poço profundo </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 poços plana </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 poços rodada </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetraciclina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robô </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> União Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA de interferência é um poderoso método para compreender a função do gene, especialmente quando conduzida a uma escala do genoma inteiro-e num contexto quantitativa. Em C. elegans, a função do gene pode ser batido para baixo de maneira simples e eficiente pela alimentação de vermes com bactérias que expressam um ARNdc que corresponde a um gene específico 1. Embora a criação de bibliotecas de clones de RNAi cobrindo a maior parte do C. elegans genoma 2,3 abriu o caminho para estudos genômicos funcionais verdadeiros (ver, por exemplo 4-7), a maioria dos métodos estabelecidos são difíceis. Moy e colegas desenvolveram semi-automatizados protocolos que facilitem genome-wide telas 8. A abordagem baseia-se na imagem microscópica e análise de imagem. Descrevemos aqui um protocolo alternativo para um alto rendimento de tela de todo o genoma, com base no manuseamento robótico da bacteriana RNAi clones, a análise quantitativa utilizando o Biosort COPAS (União Biometrica (UBI)), e umasoftware integrado: o MBioLIMS (Laboratório de Sistema de Gestão da Informação da Modul-Bio) uma tecnologia que proporciona maior produtividade para gerenciamento de dados e rastreamento de amostra. O método permite que as telas para ser conduzido em placas de meio sólido. Isto é particularmente importante para alguns estudos, como as que tratam sistema patógeno-hospedeiro interações em C. elegans, uma vez que certos micróbios não infectam eficientemente vermes em meio líquido. Nós mostramos como o método pode ser utilizado para quantificar a importância de genes em anti-fúngica imunidade inata em C. elegans. Neste caso, a abordagem baseia-se na utilização de uma estirpe transgénicos portadores uma infecção epidérmica induzível-gene repórter fluorescente, com GFP sob o controlo do promotor do gene antimicrobiana péptido nlp 29 e um repórter vermelho fluorescente que é expressa constitutivamente na epiderme. Este último apresenta um controlo interno para a integridade funcional da epidermee transgene não específica silenciamento 9. Quando vermes de controlo são infectadas pelo fungo que fluorescem verde. Derrubar por RNAi um gene necessário para a PNL 29 resultados de expressão em fluorescência reduzida após a infecção. Actualmente, este protocolo permite que mais de 3.000 clones RNAi a ser testado e analisados ​​por semana, abrindo a possibilidade de peneiramento todo o genoma, em menos de 2 meses.

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Nós descrevemos um protocolo com<em&gt; C. elegans</em&gt; E bibliotecas de alimentação RNAi que permite a medição automatizada de vários parâmetros, tais como fluorescência, tamanho e opacidade de vermes individuais de uma população. Nós dar um exemplo de um ecrã para identificar genes envolvidos na imunidade anti-fúngica inato em<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

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Biology

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