Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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Damos las gracias a D. Braendle, Kurz CL y F. Sanchis Montañana-por sus contribuciones. Este proyecto fue apoyado por becas de la ANR y el Consejo Regional PACA, y la financiación institucional del INSERM y el CNRS.

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El laboratorio de Ewbank colabora con la Unión Biometrica y Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; El protocolo actual permite a gran escala de cribado de RNAi en<em&gt; C. elegans</em&gt; En medios sólidos, utilizando el nivel de expresión de un gen reportero fluorescente como una lectura. Se ha optimizado con herramientas automatizadas para facilitar los ensayos de alto rendimiento, lo que permite un manejo fácil y rápida de grandes cantidades de muestras, de una manera eficiente, fiable y reproducible. Otros métodos se han descrito que no depender tanto de tratamiento automatizado de muestras líquidas<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Uno de los aspectos clave de la organización para que el protocolo ha sido el desarrollo de un método robusto de seguimiento de la muestra mediante la adaptación del software comercial MBioLIMS al procedimiento pantalla de RNAi en colaboración con la ModulBio empresa. En cada etapa del procedimiento, las placas están identificados por códigos de barras generados en el LIMS. Como el LIMS también registra la identidad de los clones en cada pocillo en cada placa, pasando de bien a gen putativo es simple. Y más allá de esto, los enlaces de LIMS a la base de datos de WormBase comunidad, permitiendo el acceso directo a los datos moleculares y funcionales acerca de un determinado gen. El LIMS también facilita el análisis que se llevó a cabo en la placa o incluso a nivel de cromosomas y todo el genoma. Para estos análisis, los datos se almacenan en una forma que es totalmente compatible con las herramientas descritas anteriormente, tales como COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un punto crítico experimental en el método es el ajuste de la cantidad de alimentos en relación con el número de gusanos. Para los ensayos de muchos, es esencial que los gusanos no hambre al final del experimento, pero también es importante no tener demasiada comida en el comienzo. Hemos observado que una alta densidad de alimentos disminuye la inducción de fluorescencia en el protocolo utilizando gusanos que llevan la p<em&gt; PNL-29</em&gt; :: Reportero GFP. Esto puede reflejar una disminución de la eficiencia de la infección, cuando los gusanos se cultivan en las bacterias demasiado (BS, resultados no publicados). Al mismo tiempo, las condiciones de cultivo de la bacteria ARNi también es importante, ya que esto determina si dsRNA se produce a un nivel óptimo. Algunos protocolos de RNAi a gran escala requiere la cultura de los clones de RNAi en placas de agar antes de la siembra de cultivos líquidos<sup&gt; 8</sup&gt;. Se obtuvo el silenciamiento de genes robustos omitir este paso. Hemos optado por un exceso de crecimiento de cada cultura para garantizar resultados homogéneos. El protocolo descrito en el hecho proporciona material suficiente para llevar a cabo 2 o 3 pantallas en paralelo. Con el fin de obtener los resultados más sólidos, estamos a favor, sin embargo, la realización de las pantallas en duplicado utilizando cultivos independientes de los gusanos, bacterias y esporas de hongos RNAi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Otro paso crítico está relacionado al uso de medio que no sea ni muy húmedo ni muy seco. Si las placas no se seque lo suficiente, el ARNi las bacterias no se seque correctamente y los gusanos van a nadar durante el ensayo. Esto puede causar problemas. Por ejemplo, los gusanos no son eficientemente infectados por<em&gt; D. coniospora</em&gt; En el líquido (C. Couillault, resultados no publicados). Por otro lado, en placas secas, la osmolaridad de los incrementos de medio de cultivo. Esto tiene efectos directos sobre la fisiología del gusano<sup&gt; 17</sup&gt;, Incluyendo la inducción de algunos genes de péptidos antimicrobianos, tales como<em&gt; PNL 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. El volumen utilizado para dispensar gusanos y esporas es crítico para permitir un secado rápido y eficaz. Si hay más de 10 l de líquido se añade a las placas frescas, los pocillos puede tomar muchas horas para secar. Esto puede significar que es difícil de utilizar métodos robóticos para añadir gusanos a las placas. Por ejemplo, cada gusano es dispensado por la Biosort en alrededor de 1 l de líquido. En la actualidad distribuir los gusanos de forma manual ya que también nos permite superar la tendencia de los gusanos en la solución de los sedimentos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Hemos informado anteriormente de un ajuste de la Biosort que permitió una placa de 96 pocillos a analizar en 36 minutos<sup&gt; 19</sup&gt;. IBU de la máquina fabricante ofrece ahora una modificación de la Biosort para disminuir aún más el tiempo de análisis. Con el &quot;FastReFlex&quot;, las muestras se enrutan directamente a través de la celda de flujo para el análisis, sin pasar por el filtro de burbuja trampa. Esto resulta en una reducción significativa en el tiempo para la adquisición de datos; una placa entera puede ser analizado en 22 minutos permitiendo alrededor de 20 placas a tratar por día. Si las placas no se congelaron, sin embargo, habría un intervalo de 8 horas entre las primeras y la última. Dada la relativamente corta duración del experimento, con la infección que dura sólo 18 horas, esto introduciría una variable inaceptable través de las placas. No sólo las placas de congelación antes del análisis de resolver este problema, pero también es esencial en el contexto de análisis de alto rendimiento, ya que con el protocolo actual y los robots estándar de manejo de líquidos, 2 personas puede procesar hasta 50 planchas a la semana. En la actualidad, de manera rutinaria la pantalla de 30 platos a la semana, lo que permite una pantalla de todo el genomaque se llevó a cabo una vez en menos de 2 meses.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Una característica interesante de este protocolo es el hecho de que utiliza agar sólido, permitiendo ensayos que no se pueden realizar en cultivo líquido. Como fisiología gusano difiere dependiendo de las condiciones de cultivo<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Siendo capaz de realizar los ensayos en medio sólido también puede complementar habituales pantallas de base líquida. Para ciertos fenotipos (por ejemplo, movimiento), el análisis puede llevarse a cabo directamente con placas de medio 96-bien sólidos. Para la pantalla actual, sin embargo, como la Biosort no puede muestrear de placas de medio sólido, gusanos se transfiere primero a líquido antes de la congelación. Por otro lado, la Biosort COPAS permite un análisis cuantitativo multiparamétrico compatible con la medición de muchos fenotipos diferentes. Es probable que para cualquier pantalla dado que no todos los parámetros medidos será la principal lectura. No obstante, estas medidas pueden ser útiles por varias razones. Ellos permiten una para determinar si el ensayo funcionó correctamente. Por ejemplo, se puede comprobar el número y tamaño de los gusanos en cada pocillo. Sólo cuando un clon ARNi debe bloquear el crecimiento o la reproducción no debe haber una desviación de los valores esperados. Los pozos con menos de 20 gusanos o / y de los animales un 30% más pequeños (TOF) en comparación con estándaresestándar de control sin efecto sobre el crecimiento (<em&gt; Por ejemplo, las buenas prácticas agrarias (RNAi</em&gt;)) Pueden ser excluidos de los análisis posteriores. La función de estos clones se pueden abordar utilizando un protocolo alternativo en el que los gusanos están expuestos a las bacterias RNAi después de su desarrollo está muy avanzada<sup&gt; 15</sup&gt;. Los diferentes parámetros también se pueden utilizar para refinar gen candidato (golpe) la selección, por ejemplo, la limitación de accesos sólo a los que afectan a la fluorescencia verde, pero no en rojo. El método exacto elegido para seleccionar muestras dependerá del tipo de pantalla y su exacta lectura. Dada la complejidad de los datos generados a partir de un análisis cuantitativo del genoma de pantalla ancha, la colaboración con un experto en estadística que sean necesarios.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; El protocolo se describe se puede adaptar fácilmente a otros tipos de ensayos. Por ejemplo, en la etapa de infección<em&gt; D. coniospora</em&gt; Podría ser reemplazado por cualquier otro patógeno capaz de infectar a los medios sólidos. Esto es potencialmente útil como hemos encontrado que muchos de los factores de virulencia importantes de Serratia marcescens infección en cultivo líquido no juegan un papel durante la infección en un medio sólido (E. Pradel, comunicación personal). El protocolo es también totalmente compatible con las pruebas de los compuestos químicos<sup&gt; 22-24</sup&gt;, O para identificar compuestos con actividad biológica con diferentes bibliotecas de las bacterias<sup&gt; 25</sup&gt;, Por lo que debe encontrar una utilidad general en el<em&gt; C. elegans</em&gt; Comunidad de investigación.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Bactopeptona </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Película adhesiva AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropílico β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 pozos profundos </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 96 pocillos plana </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 placa redonda y </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> La tetraciclina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robot </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Unión Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

La interferencia de ARN es un poderoso método para comprender la función de genes, especialmente cuando se realiza a escala de todo el genoma y en un contexto cuantitativo. En C. elegans, la función del gen puede ser derribado sencilla y eficaz por la alimentación de los gusanos con bacterias que expresan el dsRNA correspondiente a un gen específico 1. Si bien la creación de bibliotecas de clones de RNAi cubriendo la mayor parte de la C. elegans genoma 2,3 abrió el camino para que los verdaderos estudios de genómica funcional (véase, por ejemplo 4-7), la mayoría de los métodos establecidos son laboriosos. Moy y sus colegas han desarrollado protocolos de semi-automatizados que facilitan todo el genoma de las pantallas de 8. El enfoque se basa en imágenes microscópicas y análisis de imágenes. A continuación se describe un protocolo alternativo para un alto rendimiento en todo el genoma de pantalla, basado en la manipulación robótica de clones bacterianos ARNi, el análisis cuantitativo utilizando el Biosort COPAS (Unión Biometrica (UBI)), y unsoftware integrado: el MBioLIMS (Laboratory Information Management System de Modul-Bio) una tecnología que proporciona un mayor rendimiento para la gestión de datos y el seguimiento de la muestra. El método permite que las pantallas se llevó a cabo en placas de medio sólido. Esto es particularmente importante para algunos estudios, como los que abordan las interacciones huésped-patógeno en C. elegans, ya que ciertos microbios no son eficientes gusanos infectan en cultivo líquido. Se muestra cómo el método puede ser utilizado para cuantificar la importancia de los genes en el anti-hongos inmunidad innata en C. elegans. En este caso, el método se basa en el uso de una cepa transgénica llevar una infección epidérmica inducible del gen reportero fluorescente, con GFP bajo el control del promotor del gen del péptido antimicrobiano nlp 29 y un reportero fluorescente de color rojo que se expresa constitutivamente en el epidermis. Este último proporciona un control interno para la integridad funcional de la epidermisy no específica del transgén silenciar 9. Cuando los gusanos de control están infectadas por el hongo que presentan fluorescencia verde. Derribar por RNAi un gen necesario para la expresión resultados Nlp 29 en la fluorescencia disminuida después de la infección. En la actualidad, este protocolo permite a los más de 3.000 clones de RNAi para ser probado y analizado por semana, abriendo la posibilidad de la detección del genoma completo en menos de 2 meses.

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Se describe un protocolo de uso de<em&gt; C. elegans</em&gt; Y las bibliotecas de RNAi de alimentación que permite la medición automática de múltiples parámetros, como la fluorescencia, el tamaño y la opacidad de los gusanos individuales de una población. Damos un ejemplo de una pantalla para identificar genes implicados en la anti-hongos en la inmunidad innata<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

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Biología

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