Name: quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Vi tackar D. Braendle, CL Kurz och F. Montañana-Sanchis för deras bidrag. Detta projekt har finansierats med bidrag från ANR och Conseil Regional PACA och institutionella medel från INSERM och CNRS.

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li><li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li><li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li><li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting.">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li><li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes.">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li><li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+high-throughput+screens:+the+C+elegans+model.">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1551-8507 (2006).</li><li>Powell, J. R., Ausubel, F. M., Ewbank, J., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Caenorhabditis+elegans+Infection+by+Bacterial+and+Fungal+Pathogens.">Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens.</a> Methods Mol Biol. 415, 403-427 (2008).</li><li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNP-1/ATR-X+acts+with+RB,+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans.">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions.">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li><li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li><li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data.">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li><li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans.">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li><li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20&#47;GCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis.">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20&#47;GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li><li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome.">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+in+a+dish:+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis.">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li><li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay.">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li><li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2.">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li></ol>

Den Ewbank lab samarbetar med unionen Biometrica och Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; Den nuvarande protokollet medger storskalig RNAi screening i<em&gt; C. elegans</em&gt; På fasta medier, med användning av graden av expression av en fluorescerande reporter-gen som en utläsning. Det har optimerats med automatiserade verktyg för att underlätta hög kapacitet analyser möjliggör enkel och snabb hantering av stora antal prover, på ett effektivt, tillförlitligt och reproducerbart sätt. Andra metoder har beskrivits som inte förlitar sig så starkt på automatisk flytande provhantering<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En viktig organisatorisk aspekt till protokollet har varit utvecklingen av en robust metod för spårning av prov genom att anpassa den kommersiella MBioLIMS programvaran till RNAi skärmen förfarandet i samarbete med företaget ModulBio. Vid varje skede av förfarandet, plattor numera identifieras genom streckkoder som genereras inom LIMS. Som LIMS också registrerar identiteten på klonerna i varje brunn på varje platta, går från bra till förmodade gen är enkel. Och utöver detta, LIMS länkar till gemenskapens databas WormBase och för att direkt nå molekylära och funktionella data om en viss gen. LIMS underlättar också analyser utföras på plattan eller kromosom och hela-genomet nivå. För dessa analyser, är de data som lagras på ett sätt som är helt kompatibel med tidigare beskrivna verktyg såsom COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En kritisk experimentell punkt i metoden är en anpassning av den mängd mat i förhållande till antalet maskar. För många analyser är det viktigt att maskar inte svälta vid slutet av experimentet men det är också viktigt att inte ha för mycket mat i början. Vi har observerat att en hög täthet av föda minskar fluorescens induktion i protokollet med maskarna som bär p<em&gt; NLP-29</em&gt; :: GFP reporter. Detta kan återspegla en minskad infektion effektivitet när maskar odlas i alltför mycket bakterier (BS, opublicerade resultat). Samtidigt är de odlingsbetingelser av RNAi bakterier också viktig, eftersom denna bestämmer om dsRNA produceras vid en optimal nivå. Några protokoll för storskalig RNAi kräver odling av RNAi kloner på agarplattor före sådd flytande odlingar<sup&gt; 8</sup&gt;. Vi fick robust geners uttryck utelämnas detta steg. Vi valde för odling ett överskott av varje kultur för att säkerställa homogena resultat. Det protokoll som beskrivits i själva verket ger tillräckligt material för att utföra 2 eller 3 skärmar parallellt. Med tanke på att få de mest robusta resultaten gynnar vi dock genomföra skärmar i två exemplar med oberoende kulturer av maskar, RNAi bakterier och svampsporer.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En annan avgörande steg är relaterad till att använda medium som varken är för fuktigt eller för torrt. Om plattorna inte tillräckligt torr, inte torka RNAi bakterier inte ordentligt och maskar simmar under analysen. Detta kan orsaka problem. Till exempel är maskar inte effektivt infekteras av<em&gt; D. coniospora</em&gt; I vätska (C Couillault, opublicerade resultat). Å andra sidan, i torra plattor, osmolaritet ökar odlingsmedium. Detta har direkta effekter på masken fysiologi<sup&gt; 17</sup&gt;, Inklusive induktion av vissa antimikrobiella peptid-gener, såsom<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Volymen som används för att mata maskar och sporer är avgörande för att möjliggöra en snabb och effektiv torkning. Om mer än 10 | il av vätska tillsätts till nya plattor, kan brunnarna ta många timmar att torka. Detta kan innebära att det är svårt att använda robotar metoder för att lägga maskar i plattorna. Till exempel är varje mask dispenseras genom Biosort i omkring 1 | il av vätskan. Vi distribuerar för närvarande maskar manuellt som också tillåter oss att övervinna tendensen av maskar i lösning till sediment.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vi har tidigare rapporterat en justering av Biosort som tillät en 96-brunnars platta som ska analyseras i 36 minuter<sup&gt; 19</sup&gt;. Maskinens Tillverkaren UBI erbjuder nu en modifiering av Biosort att minska ytterligare analysen tiden. Med &quot;FastReFlex&quot;, är proverna direkt dirigeras genom flödescellen för analys, och kringgå bubbla-fällan filtret. Detta resulterar i en betydande minskning av tiden för datainsamling, en hel platta kan analyseras i 22 min så ca 20 plattor som ska behandlas per dag. Om plattorna inte frystes emellertid skulle det finnas en 8 timmars intervall mellan de första och sista sådana. Med tanke på den relativt korta tid av experimentet, med infektionen varar bara 18 timmar, skulle detta medföra en oacceptabel variabel över plattorna. Inte bara frysa plattor före analys lösa detta problem, men det är också viktigt i samband med hög kapacitet analyser som, med den nuvarande protokollet och standard flytande hantering robotar, kan 2 personer lätt bearbeta upp till 50 plattor i veckan. För närvarande har vi rutinmässigt skärmen 30 plattor i veckan, vilket möjliggör en hel-genomet skärmensom skall utföras en gång på mindre än 2 månader.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En intressant egenskap hos detta protokoll är att den använder fast agar, så analyser som inte kan utföras i flytande kultur. Som mask fysiologi skiljer sig beroende på odlingsbetingelserna<sup&gt; 20,21</sup&gt; Att kunna utföra analyser på fast medium kan också komplettera vanliga vätskebaserade skärmar. För vissa fenotyper (t.ex. rörelse), kan analysen utföras direkt med 96-håls fast medium plattor. För den aktuella skärmen, men kan då Biosort inte provsmaka från fasta medium plattor är maskar överförs först till flytande före frysning. Å andra sidan medger den copas Biosort en multiparameter kvantitativ analys kompatibel med mätningen av många olika fenotyper. Det är troligt att för varje given skärm inte alla de uppmätta parametrarna kommer att vara den primära utlästa. Icke desto mindre kan dessa mätningar vara användbara av flera skäl. De tillåter en att bestämma huruvida analysen fungerade korrekt. Till exempel kan en kontroll av antalet och storleken av maskar i varje brunn. Endast om en RNAi-klon bör blockera tillväxt eller reproduktion bör det finnas en avvikelse från förväntade värden. Brunnar med mindre än 20 maskar och / eller djur 30% mindre (TOF) jämfört med en standarddard kontroll utan någon effekt på tillväxt (<em&gt; T.ex. GFP (RNAi</em&gt;)) Kan uteslutas från efterföljande analyser. Funktionen av dessa kloner kan adresseras med ett alternativt protokoll, där maskarna utsätts för RNAi bakterier efter deras utveckling är långt<sup&gt; 15</sup&gt;. De olika parametrar kan också användas för att förfina kandidat gen (träff) urval, till exempel, begränsa hits bara till dem som påverkar grön fluorescens men inte röd. Den exakta metod som valts för att välja träffar beror på vilken typ av skärmen och dess exakta avläsning. Med tanke på komplexiteten i de data som genererats från en kvantitativ genomet bred skärm, kan samarbete med en statistiker krävas.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Protokollet beskriver vi kan lätt anpassas till andra typer av assayer. Till exempel, vid infektion steg<em&gt; D. coniospora</em&gt; Skulle kunna ersättas av någon annan patogen förmåga att infektera på fasta medier. Detta är potentiellt användbara som vi har funnit att många av de virulensfaktorer viktiga för Serratia marcescens infektion i flytande kultur inte spelar en roll vid infektion på fast medium (E. Pradel, personlig kommunikation). Protokollet är också helt kompatibel med tester av kemikalier föreningar<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Eller identifiera föreningar med bioaktivitet med olika bibliotek av bakterier<sup&gt; 25</sup&gt; Bör så hitta en allmän användbarhet i<em&gt; C. elegans</em&gt; Forskarsamhället.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Baktoagar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214.010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Baktopepton </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211.677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2- </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal limfilm </td><td> Dutscher </td><td> 760.214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropyl β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 djup brunnsplatta </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 brunnar och plan platta </td><td> FALK </td><td> 353.072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 brunnar och rund platta </td><td> FALK </td><td> 353.077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracyklin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> En leverantör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN roboten </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copas Biosort </td><td> Förbundet Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and automated high-throughput genome-wide rnai screens in c. elegans

RNA-interferens är en kraftfull metod för att förstå genfunktion, speciellt när den genomföres vid en hel-genomet skala och en kvantitativ sammanhang. I C. elegans, kan genfunktion slås ned på ett enkelt och effektivt genom att mata maskar med bakterier som uttrycker ett dsRNA motsvarande en specifik gen 1. Även skapandet av bibliotek av RNAi kloner som täcker det mesta av C. elegans genomet 2,3 öppnade vägen för äkta funktionella genomiska studier (se till exempel 4-7), de flesta etablerade metoder är arbetskrävande. Moy och kollegor har utvecklat halvautomatiska protokoll som underlättar genom-bredbildsskärmar 8. Det tillvägagångssätt förlitar sig på mikroskopisk avbildning och bildanalys. Här beskriver vi ett alternativt protokoll för en hög genomströmning genomet bred skärm, som bygger på robot hantering av bakteriell RNAi kloner, kvantitativ analys med hjälp av copas Biosort (Union Biometrica (UBI)), och enintegrerad programvara: det MBioLIMS (Laboratory Information Management System från Modul-Bio) en teknik som ger ökad genomströmning för datahantering och prov spårning. Metoden tillåter skärmar som skall utföras på fast medium-plattor. Detta är särskilt viktigt för vissa studier, såsom de behandlar värd-patogen interaktioner i C. elegans, eftersom vissa mikrober inte effektivt infektera maskar i flytande kultur. Vi visar hur metoden kan användas för att kvantifiera vikten av gener i antifungal medfödd immunitet i C. elegans. I detta fall förlitar sig metoden för användning av en transgen stam som bär en epidermal infektion-inducerbar fluorescerande reporter-gen, med GFP under kontroll av promotorn i den antimikrobiella peptiden genen nlp 29 och en röd fluorescerande reporter som uttrycks konstitutivt i de epidermis. Den senare ger en intern kontroll för den funktionella integritet epidermisoch icke-specifik transgen tysta 9. När kontroll maskar är infekterade av svampen som de fluorescerar grönt. Riva ned med RNAi en gen som krävs för NLP 29 uttryck resulterar i minskad fluorescens efter infektion. För närvarande tillåter detta protokoll mer än 3000 RNAi kloner som ska testas och analyseras varje vecka öppnar möjligheten att screena hela genomet på mindre än 2 månader.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans at JoVE.com

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Vi beskriver ett protokoll med<em&gt; C. elegans</em&gt; Och RNAi bibliotek utfodring som möjliggör automatisk mätning av flera parametrar såsom fluorescens, storlek och opacitet enskilda maskar i en population. Vi ger ett exempel på en skärm för att identifiera gener involverade i antifungal medfödd immunitet i<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Kvantitativa och automatisk hög genomströmning Genomvid RNAi skärmar i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Utveckling av automatiserad bildbehandling och analys för zebrafisk kemiska skärmar.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomvid Analys med hjälp av chip för att identifiera isoform-specifik gen mål

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletioner i<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Av High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans kemotaxianalys

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biokemisk och hög kapacitet Mikroskopisk bedömning av fettmassa i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...