Name: high content screening in neurodegenerative diseases
Uploaded: 2012-01-06T13:00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Content Screening in Neurodegenerative Diseases at JoVE.com

Vi takker Hamilton programmerere og spesialister for videre støtte og Eva Blaas for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av to NWO Investeringstilskudd (911-07-031 og 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 og Neuroscience Campus Amsterdam, SJ er støttet av Ti-Pharma: T5-207.

1. Automatisert tilhenger cellekultur prosess (figur 1) 20 <ol><li> Klargjør automatiserte cellekultur system for input av cellekultur plater. Load forbruksmateriell (f.eks pipettespisser, cellekultur plater, assay plater) inn i systemet med det grafiske brukergrensesnittet (GUI). Sørg for tilstrekkelig cellekultur media, buffered fosfat saltløsning (PBS) og trypsin i robot-system. </li><li> Manuell seed to omnitray tallerkener med 2 x 10 6 celler per plate, av SH-SY5Y neuroblastom cellelinje. Vedlikeholde celler i Opti-MEM med 10% fetal bovine serum (FBS). Sett platene inn i cellekultur robot med GUI. Cellene skal inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2. </li><li> Velg hvilke cellekultur protokoll må settes i gang 20. Man kan velge fra en tilhenger cellekulturprosessen 22, dyrking og utvidelse av embryonale stamceller (ES) celler på mus mater celler 23 eller dyrking av suspensjon cells 22. </li><li> Velg heftende cellekultur-protokollen (figur 1) og sikre tilhenger cellelinje spesifikke parameter filer blir justert slik at samløpet terskelen (det området av omnitray plate som inneholder celler) er satt til 70%. Still total trypsinization tid til to minutter. </li><li> Instruer roboten til å forberede nye omnitray tallerkener, med seeding celle nummer på 2 x 10 6 celler per plate. </li><li> Input omnitray platene i cellekultur systemet ved hjelp av automatiserte heftende cellekultur-protokollen (figur 1). Denne protokollen omfatter følgende trinn: plater inkuberes og avbildes til de når de forhåndsdefinerte samløpet terskel. Hvis cellene ikke når samløpet terskelen innen 5 avlesninger, er plater fjernet fra systemet. Når du har nådd den brukerdefinerte samløpet terskel, blir cellene vasket, trypsinized og telles. En pre-definerte antall celler blir lagt til nye omnitray plater og hvis det er tilstrekkelig antall celler, en spesifisert nummener av analysen platene er transportert til dekk og et definert antall celler dispensed i hver brønn. Analysen plater kan være direkte avbildes med integrerte mikroskop eller output fra systemet for videre behandling. </li><li> Instruere systemet til å forberede fire assay plater per omnitray plate, med en total på 5.000 celler per brønn. </li></ol> 2. shRNA virus produksjon og platekledning i analysen plater (Time kreves: 6 dager) <ol><li> Grow bakteriell glyserol aksjer som inneholder shRNA vektorer (Open Biosystems, TRC1) over natten i 2 ml Luria-Bertani medium media som inneholder 100 mikrogram / ml ampicilin (Sigma-Aldrich). </li><li> Pakk plasmider følge produsentens protokollen (Promega Wizard MagneSil TFX). </li><li> Produser virus bruker RNAi Consortium high-throughput Lentiviral Produksjon (96 bra plate) protokoll 24. Arbeide med lentivirus er relativt trygt fordi viruset partikler som brukes for transduksjon er replikering-mangelfull og split-gen emballasje strategier benyttes for sin produksjon. Men når du arbeider med lentivirus, ekstra biosikkerhet prosedyrer er nødvendig for å minske risikoen for seg selv og andre 25. Alle forsøkene skal gjennomføres på en MLII eller BSL2 sikkerhetsnivå laboratorium. All plast (pipetter, plast retter, media) som har vært i kontakt med lentivirus partikler skal inkuberes med blekemiddel i 24 timer før avhending. </li><li> Beregn mangfoldet av infeksjon (MOI) av lentivirus ved å bestemme hvor stor prosentandel av GFP positive celler ved hjelp av pLKO.1 GFP plasmid (Sigma-Aldrich). </li><li> Plate lentivirus i analysen plater, med en MOI på 3. </li></ol> 3. Lentiviral transduksjon og neuronal differensiering av SH-SY5Y celler (Nødvendig tid: 6 dager) <ol><li> Cellene er lagt til analysen platene (se steg 1,7). Load analysen plater inneholder shRNA lentivirus i den automatiserte cellekultur system. </li><li> Etter 24 timer, media påanalysen plater vil bli endret til Opti-MEM som inneholder 0,5% FBS og 0,1 mM retinsyre å begynne differensiering prosessen. Differensiering av SH-SY5Y celler gir visualisering av neuritic strukturer og synkroniserer celledeling. </li><li> Fortsett inkubasjon av analysen platene i differensieringen media for 5 dager. Dette sikrer maksimal knockdown av målet genuttrykk. </li><li> På dag 5, tilsett 50 mM H 2 O 2 til halvparten av analysen plater i 24 timer for å stimulere translokasjon av DJ1 til mitokondriene. </li><li> På dag 6, legg Mitotracker CmxROS (Invitrogen) til cellene, til en endelig konsentrasjon på 200 nM per brønn og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. </li><li> Man kan instruere systemet til bildet plater direkte ved hjelp av HC kameraet eller plater kan eksporteres fra systemet for videre behandling. </li></ol> Fire. Automatisert farging av analysen plater (Nødvendig tid: 2 dager) Bildekvalitet er paramount for å gjennomføre en sensitiv og pålitelig HCS. Skade på cellular monolayer grunnet unøyaktig pipettering kan føre til dårlig bildekvalitet og uforklarlige resultater. For å minimere celle laget skade, var farging gjennomført ved hjelp av en robot stasjon. Prosedyren er lik en som har vært tidligere beskrevet 26, men har blitt tilpasset for å øke gjennomstrømningen og redusere forbruksmateriell bruk. <ol><li> Fix celler med 100 mL 4% Paraformaldehyde forvarmet til 37 ° C. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. </li><li> Vask cellene med 200 mL PBS i 5 minutter, 3 ganger. </li><li> Inkuber analysen plater med 200 mL PBS som inneholder 0,1% Triton (PBST) i 10 minutter. </li><li> Vask cellene med 200 mL PBS i 5 minutter, 3 ganger. </li><li> Inkuber analysen plater med 200 mL av blokk buffer (PBST med 5% FBS) i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Vask cellene med 200 mL PBS i 5 minutter, 3 ganger. </li><li> Inkuber med Føllgrunn primære antistoffer over natten ved 4 ° C: <ol><li> Goat DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mikrogram / ml) </li><li> Rabbit β-III tubulin (Sigma-Aldrich, 1 mikrogram / ml) </li></ol></li><li> På de neste dagen, vask celler med 200 mL PBS i 5 minutter, 3 ganger. </li><li> Inkuber analysen plater med følgende sekundære antistoffer 1 time ved romtemperatur: <ol><li> AlexaFluor 488 esel anti-geit (Invitrogen, 2 mikrogram / ml) </li><li> AlexaFluor 647 geit anti-kanin (Invitrogen, 2 mikrogram / ml </li></ol></li><li> Vask cellene med 200 mL PBS i 5 minutter, 3 ganger. </li><li> Inkuber cellene med Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) i 10 minutter. </li><li> Vask cellene med 200 mL PBS i 5 minutter, 3 ganger. </li><li> Oppbevar plater ved 4 ° C inntil de kan avbildes. </li></ol> 5. Høyt innhold image oppkjøp og bildeanalyse (Time nødvendig: 5 dager) <ol><li> Bilde totalt 30 felt per brønn med 20x objektiv. Visualiser DJ1 med FITC filter sett, mitokondriene med TRITC filter sett, β-III tubulin med Cy5 filter sett og kjerner med UV-filter sett (figur 3). </li><li> Analyser bilder ved hjelp av compartment Analysis Bioapplication (Cellomics, ThermoFisher) for å bestemme den gjennomsnittlige intensiteten av Mitotracker signal i mitokondriene. (4B figur, F). </li><li> Å bestemme den gjennomsnittlige overlapping koeffisient mellom DJ1 og mitokondrier, analysere bildene ved hjelp av Cellomics Colocalisation bioapplication (Cellomics, ThermoFisher). Definer regioner av interesse (ROI) som følger: ROI A - nucleus (4A figur, E), ROI B - mitokondriene (figur 4 B, F). Utelukk ROI A fra ROI B for å sikre analyse av bare cytoplasma. Definer mitokondrier som målområdet jeg og DJ1 som target regionen II (Figur 4C, G). </li><li> Analyser bilder ved hjelp av nevronale Profiling bioapplication (Cellomics, Thermofisher) å spore den gjennomsnittlige lengden på neurites fra β-III tubulin flekker (Figur4D, H). </li><li> Bilde plater bruker Opera LX automatiserte confocal kortleser (Perkin-Elmer). Bilde totalt 30 felt per brønn med 60x objektiv med nedsenking i vann. Visualiser mitokondrier med 561 nM laser og kjerner med UV eksitasjon. </li><li> Analysere bildene med Spot-Edge-Ridge (SER) tekstur funksjoner algoritme. Den SER-Ridge filter overfører intensitet i piksler danner rygg-lignende mønstre. Jo mer fragmentert mitokondriene, jo høyere SER-Ridge score (Figur 8). </li></ol> Seks. Data normalisering og analyse <ol><li> Importer data fra bildeanalyse programvare i BioConductor CellHTS2 pakke for R-programvare miljøet (R versjon 2.11.1, BioConductor versjon 2.6). </li><li> Logaritmen base (2) transformere data før per plate median basert normalisering 27, 28. Ikke påfør variansen justeringen per plate. </li><li> Å identifisere modifikatorer av en fenotype, bruk en toveis ANOVA mellom different behandlingsgruppene dvs eggerøre smittet ubehandlet celler vs eggerøre toxin behandlede cellene vs target genet ubehandlet celler vs target gen behandlet celler (figur 5-7). </li></ol> 7. Representative resultater Mutasjoner i DJ1 gi opphav til tidlig debut-recessiv parkinsonisme 21, men det er uklart hvordan tap av DJ1 gir opphav til sykdommen fenotype. Det er kjent at celler mangelfull av DJ1 er mer utsatt for oksidativt stress-indusert celledød og som respons på oksidativt stress, DJ1 translocates fra cytoplasma til mitokondriene 29, 30. Ved å bygge HC-analyser for å overvåke disse fenotyper, kan vi identifisere gener som regulerer eller påvirke fenotyper assosiert med DJ1. Denne tilnærmingen kan bidra til å dechiffrere stiene innen hvilke DJ1 funksjoner og som kan være involvert i sykdom patogenesen. Eksempel på en epistatic interaksjon med DJ1 (figur 5): knockdown av DJ1 i celler utsatttil toksin resulterer i en større tap av celleviabilitet (BAR-B: image-B) sammenlignet med celler infisert med eggerøre lentivirus (BAR-A: image-A). Knockdown av målet gen A har en lignende effekt som er observert i celler med en DJ1 knockdown (BAR-C: image-C). Knockdown både DJ1 og målet gen A resulterer i et betydelig større tap av celleviabilitet enn tap av enten genet alene (BAR-D: image-D). Dette antyder en epistatic samspill mellom DJ1 og målet genet A. Eksempel på et gen som regulerer DJ1 translokasjon (figur 6): Når celler blir utsatt for en gift, DJ1 translocates fra cytoplasma til mitokondriene, som er kvantifisert ved et høyere overlapping koeffisient mellom DJ1 og mitokondrier (BAR-A: image A versus BAR-C: image C). I cellene hvor target genet B har blitt brakt til taushet, mindre DJ1 translocates til mitokondriene når cellene blir utsatt for toksinet. Dette tyder på at målet genet B er involvert i transport av DJ1 til mitokondriene. (BAR-B:<html> image B og BAR-D: image D) Eksempel på et gen som er involvert i nevronale utvekst (figur 7): knockdown av målet gen C i villtype SH-SY5Y cellene resulterer i en betydelig økning i neurite lengde (BAR-B: image-B) sammenlignet med celler infisert med lentivirus uttrykke eggerøre shRNA (BAR-A: image A). Denne effekten er tapt i celler inkubert med toksin (BAR-C og D). Eksempel på et gen som er involvert i mitokondriell morfologi (Figur 8): Infeksjon av villtype SH-SY5Y celler med shRNA targeting genet D resulterer i en reduksjon i mitochondrial SER-Ridge segmentering verdi (Figur 8, bilde C og D) sammenlignet med celler infisert med eggerøre lentivirus (Figur 8, Bilde A og B). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" /></a> Figur 1 Omriss av automatiserte cellekultur protokoll. ntent &quot;&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" /></a> Figur 2 Skjematisk oversikt over screening prosessen, bildeanalyse og statistiske metoder som brukes under screening prosessen. I) Cellene er dyrket til de er confluent og senere belagt i analysen platene inneholder shRNA lentivirus. Cellene er differensiert for 5 dager og gift er deretter lagt på platene i 24 timer. Assay platene er utgang fra systemet og immunostained. Tiden det tar for hver av prosessene er angitt i parentes. ii) Data er anskaffet ved hjelp av en HC imager (celleviabilitet, protein translokasjon og neuronal utvekst) og en automatisert confocal imager (mitochondrial morfologi). Data eksporteres til CellHTS2 pakke innenfor R, base (2) log transformert og normalisert. Toveis ANOVA brukes til å identifisere viktige interaksjoner mellom de ulike variablene. Figur 3. Composite bilder av celler kjøpt av HC imaging. A) Ubehandlet celler, B) Celler behandlet med H 2 O 2. DJ1 er merket i grønt, mitokondriene i rødt og kjernene i blått. Neurite farging er ikke uthevet. <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" /> Figur 4. Kvantifisering av flere cellulære funksjoner hentet fra en HCS. AD) Ubehandlet SH-SY5Y celler. EH) H 2 O 2 behandlet SH-SY5Y celler. A, E) kjernene segmentering og definisjon av ROI A, B, F) Identifisering og kvantifisering av mitokondrier, ROI B, C, G) Identifikasjon av DJ1, Target kanal II, D, G) Identifikasjon og beregning av gjennomsnittlig neurite lengde. Celler nær kanten av bildet er ekskludert fra analysen. Innsatt bilder er bilder før analyse. <imgalt = &quot;Figur 5.&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg&quot; /&gt; Figur 5. Identifisering av et gen i epistasis med DJ1 (bokstaver på barene svarer til bokstavene på bildene). Bilder fra A til D er SH-SY5Y celler merket med Mitotracker CMXRos (rød) som ble brukt for kvantifisering av celle helse. <img alt="Figur 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" /> Figur 6. Identifisering av et gen som regulerer DJ1 translokasjon (bokstaver på barene tilsvarer lettering på bildene). Bilder fra A til D er SH-SY5Y celler merket for DJ1 (grønn), mitokondrier (rød) og kjerner (blå) som ble brukt for kvantifisering av DJ1 translokasjon til mitokondriene. <img alt="Figur 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" /> Figur 7. Identifisering av et gen som er involvert i nevronale utvekst (bokstaver på barene tilsvarer lettering på bildene). Bilder fra A til D er SH-SY5Y celler merket for β-III tubulin (grønn) og kjerner (blå) som ble brukt for kvantifisering av neurite lengde. <img alt="Figur 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" /> Figur 8. Identifisering av et gen som er involvert i regulering mitochondrial morfologi. Bilde A og C er sammensatte bilder av SH-SY5Y celler infisert med eggerøre shRNA eller en shRNA targeting genet D hhv. Mitokondrier er farget i rødt mens atomkjerner er farget i blått. Bilde B og D er visualiseringer av SER-Ridge kvantifisering.

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461, 908-915 (2009).</li><li>Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+'omic'+information:+a+bridge+between+genomics+and+systems+biology.">Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology.</a> Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).</li><li>Zhu, H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Omic'+approaches+for+unraveling+signaling+networks.">'Omic' approaches for unraveling signaling networks.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68, 207-217 (2010).</li><li>Manolio, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Nalls, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson's+disease:+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies.">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377, 641-649 (2011).</li><li>Simon-Sanchez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+confirms+extant+PD+risk+loci+among+the+Dutch.">Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch.</a> Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).</li><li>Van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductionism+and+complexity+in+molecular+biology.+Scientists+now+have+the+tools+to+unravel+biological+and+overcome+the+limitations+of+reductionism.">Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism.</a> EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).</li><li>Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+needle+in+the+haystack:+why+high-throughput+screening+is+good+for+your+health.">Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health.</a> Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Introduction: cell-based assays for high-throughput screening.</a> Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).</li><li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+trends+in+high-throughput+screening.">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).</li><li>Conrad, C., Gerlich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscopy+for+high-content+RNAi+screening.">Automated microscopy for high-content RNAi screening.</a> J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).</li><li>Thomas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening:+a+decade+of+evolution.">High-content screening: a decade of evolution.</a> J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+analysis+in+neuroscience.">High-content analysis in neuroscience.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).</li><li>Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+neurodegeneration+and+complex+disease+phenotypes.">High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).</li><li>Durr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hit+identification+by+quality+assurance+and+multivariate+data+analysis+of+a+high-content,+cell-based+assay.">Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay.</a> J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).</li><li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationships+between+huntingtin+levels,+polyglutamine+length,+inclusion+body+formation,+and+neuronal+death+provide+novel+insight+into+huntington's+disease+molecular+pathogenesis.">Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis.</a> J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).</li><li>Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Automation+of+Cell+Culture.">The Complete Automation of Cell Culture.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).</li><li>Bonifati, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DJ-1+gene+associated+with+autosomal+recessive+early-onset+parkinsonism.">Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism.</a> Science. 299, 256-259 (2003).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+Subculturing+Mammalian+Cells.">Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).</li><li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li><li>Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen.">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124, 1283-1298 (2006).</li><li>Volksgezondheid, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrale+versie+van+de+Regeling+genetisch+gemodificeerde+organismen+en+het+Besluit+genetische+gemodificeerde.">Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde.</a> Organismen. , (2004).</li><li>Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+and+Astrocyte+Co-Culture+Assay+for+High+Content+Analysis+of+Neurotoxicity.">A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity.</a> J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).</li><li>Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+normalization+methods+for+Drosophila+RNAi+genomic+screens+and+development+of+a+robust+validation+scheme.">An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme.</a> J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).</li><li>Canet-Aviles, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+DJ-1+is+neuroprotective+due+to+cysteine-sulfinic+acid-driven+mitochondrial+localization.">The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).</li><li>Blackinton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+stabilized+cysteine+sulfinic+acid+is+critical+for+the+mitochondrial+function+of+the+parkinsonism+protein+DJ-1.">Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1.</a> J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).</li><li>Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+inhibitors+of+cancer+stem+cells+by+high-throughput+screening.">Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening.</a> Cell. 138, 645-659 (2009).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137, 835-848 (2009).</li><li>Mouchet, E. H., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+in+oncology+drug+discovery:+opportunities+and+challenges.">High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges.</a> IDrugs. 11, 422-427 (2008).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).</li><li>Ross, P. J., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+complex+neuropsychiatric+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells.</a> F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre

Med den synkende kostnadene for HT / HC cellulære screening systemer, kombinert med tilgjengeligheten av kraftige genome-wide verktøy for å endre gen-funksjon, er HT / HC-skjermer blir vanlig i akademia. Tilnærmingen har allerede blitt brukt til ulike forskningsområder som identifisering av narkotika mål i 9 kreft, 31-33 og embryoutvikling 34-36 og selv har potensial for anvendelse i tyde på stier involvert i nevropsykiatriske lidelser 37,38. Men gjennomføring av et slikt system krever en betydelig investering av tid og krefter med prosessoptimalisering ofte ta minimum 6 måneder. Alle trinn, slik som trypsinization tider, pipettering hastigheter og seeding tettheter må justeres, for å sikre at cellene er friske og vokser stadig. Forebygging av bakteriell forurensning er en av de vanskeligste utfordringene automatisert cellekultur med ukentlig rengjøring protokoller i combination med konstant skylling av alle flytende peilelinjaler med 70% etanol er nødvendig for forurensning gratis kulturer. Det vil også være nødvendig å forbedre robotikk, slik at flere instrumenter, slik som confocal mikroskoper for høyere oppløsning og -80 ° C frysere for sammensatte lagring kan bli integrert. Det er også begrensninger som må tas opp for å forbedre den følsomme, hastighet og nytten av denne metoden for å studere gen nettverk og identifisere gener involvert i patogene molekylære stier. Å gjennomføre en HT / HC-skjermen og sørge for at pålitelige data samles inn, flere aspekter må optimaliseres. Først er påliteligheten av målingen Paramount og er avhengig av robusthet og følsomhet analysen. For eksempel analysene beskrevet ovenfor er egnet for mindre skjermer, men er vanskelig å gjennomføre på et genom bred skala, på grunn av antall prosesstrinn kreves før image oppkjøpet.Dermed ville man nødt til å konstruere stabile cellelinjer som uttrykker reporter genet, som ville tillate for direkte avbildning og føre til redusert variasjon på grunn av redusert antall prosessering trinn. I dag utforme en analyse som nøyaktig viser og pålitelig kvantifiserer en fenotype av interesse er en stor flaskehals i HC screening prosessen. Mange skjermer er utført i mammalske celler ved hjelp av ulike RNAi biblioteker, som alle lider av off-target effekter, begrenset genet tie effektivitet og ufullstendig genomet dekning. Dermed bibliotekene må gjøres som er mer spesifikke, potent og har bedre dekning. Det arbeides med å lage slike det er håpet slike bestrebelser vil øke reproduserbarheten av HT / HC scre<html> no treff. En begrensning av mange store celle baserte skjermer er at de er utført i neuroblastom celler fordi de kan være genetisk manipulert og kultivert til store tall med relativ letthet. Imidlertid er relevansen av &#39;hits&#39; identifisert i ex vivo cellekultur modeller til in vivo fungere tvilsom, spesielt ettersom hjernen består av høyt spesialiserte celletyper som danner et tett og komplisert nettverk av synaptiske forbindelser til å fungere som en svært integrert enhet. Som en konsekvens, er det vanlig at treffer identifiseres ved hjelp av screening tilnærmingen beskrevet ovenfor, er validert i sekundære skjermer bruke ekstra teknikker og i flere fysiologiske relevante modeller 39. For å forbedre oversettelsen av hits avdekket under HCS, mer representativt og sofistikerte modeller, slik som primær cellene og differensierte stamceller eller co-kulturen systemer må utvikles og tilpasses for HT / HC tilnærminger. ntent &quot;&gt; Med en kombinasjon av automatiserte celledyrking og HC bildebehandling kan man raskt få ny innsikt i hvordan nerveceller funksjon og bestemme hvilke veier er viktig for sykdomsutvikling. kombinere HCS / HTS data med informasjon generert fra andre&quot; omics &quot;nærmer seg, vil det da være mulig å konstruere en systembiologi oversikt over hjernens sykdommer, og dermed tilrettelegge for terapeutisk utvikling.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Retinsyre </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY PLATER </td><td> Nunc </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 GODT KULTUR PLATER </td><td> Grenier </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 ANTISTOFFSPESIFISITET </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III tubulin ANTISTOFFSPESIFISITET </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> MITOTRACKER CMXROS </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> Hoechst-33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> Hydrogenperoksid </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> DULBECCO&#39;S Fosfatbufret saltvann </td><td> Invitrogen </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA VEIVISER MAGNESIL TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> SHRNA kloner </td><td> OPEN Biosystems </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS BIOAPPLICATIONS </td><td> THERMO-FISHER </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

high content screening in neurodegenerative diseases

Den funksjonelle annotering av genomer, bygging av molekylære nettverk og romanen narkotika mål identifikasjon, er viktige utfordringer som må tas opp som en sak av stor haster 1-4. Flere komplementære &#39;omics&#39; tilnærminger har gitt ledetråder til den genetiske risikofaktorer og sykdomsfremkallende mekanismer underliggende mange nevrodegenerative sykdommer, men de fleste funn fortsatt krever funksjonelle validering 5. For eksempel er en nylig genom bredt forening studie for Parkinsons sykdom (PD), identifisert mange nye loci som risikofaktorer for sykdommen, men den underliggende utløsende variant (s) eller sykdomsfremkallende mekanisme ikke kjent 6, 7. Som hvert tilhørende område kan inneholde flere gener, ville funksjonell evaluering av hver av gener på fenotyper assosiert med sykdommen, ved hjelp av tradisjonelle cellebiologi teknikker tar for lang tid. Det er også behov for å forstå de molekylære nettverk som lenkergenetiske mutasjoner til fenotyper de forårsaker. Det forventes at sykdommen fenotyper er resultatet av flere interaksjoner som har blitt forstyrret. Rekonstruksjon av disse nettverkene bruker tradisjonelle molekylære metoder vil være tidkrevende. Videre vil nettverket spådommer fra uavhengige studier av individuelle komponenter, reduksjonisme tilnærming, sannsynligvis undervurdere nettverket kompleksitet 8. Dette undervurdering kan, delvis forklare den lave suksessrate på narkotika godkjennelse på grunn av uønsket eller giftige bivirkninger. Å få et nettverk perspektiv av sykdomsrelaterte pathways bruker HT / HC cellular screening tilnærminger, og identifisere viktige noder i disse banene, kan føre til identifisering av mål som er mer egnet for terapeutisk intervensjon. High-throughput screening (HTS) er en ideell metode for å løse disse problemene 9-12. men tradisjonelle metoder ble endimensjonalt hel-brønn celle-analyser, som pleide å forenklestic avlesninger for komplekse biologiske prosesser. De var ikke i stand til samtidig kvantifisere mange fenotyper observert i nevrodegenerative sykdommer som aksonal transport underskudd eller endringer i morfologi egenskaper 13, 14. Denne tilnærmingen kunne ikke brukes til å undersøke dynamiske natur cellulære prosesser eller sykdomsfremkallende hendelser som oppstår i en undergruppe av celler. Å kvantifisere slike funksjoner man har å flytte til multi-dimensjonale fenotyper kalt high-innhold screening (HCS) 4, 15-17. HCS er cellen-basert kvantifisering av flere prosesser samtidig, noe som gir en mer detaljert fremstilling av cellulær respons til ulike forstyrrelser i forhold til HTS. HCS har mange fordeler over 18 HTS, 19, men gjennomfører en high-throughput (HT)-high-innhold (HC)-skjermen i neuronal modeller er problematisk på grunn av høye kostnader, miljø variasjon og menneskelige feil. For å påvise cellulære responser på en &#39;phenomics&#39; skalahjelp av HC bildebehandling man har til å redusere variasjon og feiling, mens økende følsomhet og reproduserbarhet. Heri vi beskriver en metode for nøyaktig og pålitelig oppførsel shRNA skjermer bruker automatiserte celledyrking 20 og HC bildebehandling i neuronal cellulære modeller. Vi beskriver hvordan vi har brukt denne metoden for å identifisere modulatorer for ett bestemt protein, DJ1, som når mutert forårsaker autosomal recessiv parkinsonisme 21. Kombinere allsidig HC bildebehandling med HT metoder, er det mulig å nøyaktig kvantifisere en mengde fenotyper. Dette kan senere benyttes til å fremme vår forståelse av genomet, den veier involvert i sykdom patogenesen samt identifisere potensielle terapeutiske mål.

Watch this Scientific Journal Video about High Content Screening in Neurodegenerative Diseases at JoVE.com

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Vi beskriver en metode som kombinerer automatisert celledyrking med høyt innhold bildebehandling for å visualisere og kvantifisere multiple cellulære prosesser og strukturer i en high-throughput måte. Slike metoder kan hjelpe i den videre funksjonell annotering av genomer samt identifisere sykdom genet nettverk og potensielle narkotika mål.

Høyt innhold Screening i nevrodegenerative sykdommer

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Bruk av primære humane fibroblaster for overvåking Mitokondrielle Fenotyper i feltet av Parkinsons sykdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening for Melanom Modifiers ved hjelp av en Sebrafisk stedegen Tumor Model

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging i Analyse av nevrodegenerative sykdommer

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

Påvisning av sykdomsassosierte α-synuclein med utvidet ELISA i hjernen hos transgene mus som overuttrykker humant A53T Mutert α-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

En High-innhold<em&gt; In Vitro</em&gt; Bukspyttkjertelen Islet β-celle Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En høy gjennomstrømning, multiplekset og målrettet proteomikk CSF-analyse for å kvantifisere nevrodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E-isoformer Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

longitudinal<em&gt; I Vivo</em&gt; Imaging av Cerebrovasculature: Relevans til CNS sykdommer

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

En elektrokjemiluminescens med høy gjennomstrømning 7-plex analyse samtidig screening for type 1 diabetes og flere autoimmune sykdommer

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate ...