Name: electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (WE849/16 1 / 2 الى دينار وRW). ونحن ممتنون ليولر توماس (Töbingen والمانيا) لتحفيز QDS البرامج الخفيفة.

الوصف التالي يفترض أن لديه فهم المجرب الأساسية للبنية شبكية العين ، وتسجيل التصحيح ، المشبك ، والفحص المجهري لمدة الفوتون. للحصول على معلومات مفيدة حول إنشاء وتشغيل الإعداد التصحيح ، المشبك واثنين من الفوتون نظام التصوير نرى الحكام [7-12]. 1. الأنسجة الحيوانية وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الماوس مظلمة مكيفة لا يقل عن 3 ساعة في غضون ذلك ، وإعداد 1-2 لتر من حل خارج الخلية التي تتكون من (مم) 125 كلوريد الصوديوم ، و 2.5 بوكل ، 1 CaCl 2 و 1.6 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 و 10 مد الجلوكوز ويوازن إلى 7.4 درجة الحموضة بالغاز مع كربوجين (CO 2 5 ٪ في O 2) في درجة حرارة الغرفة. </li> a <li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس في غرفة محكمة الغلق بواسطة جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون 2 تليها خلع عنق الرحم. يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء ، والخطوات التالية في الظلام. استخدام خافت الإضاءة طويلة الموجة (نحن كتلة موجات قصيرة من مصدر ضوء بارد من قبل 690 نانومتر longpasفلتر) لدعم رؤية شخصية مع الحفاظ على أعين الحيوان مظلمة مكيفة (الفئران لا تملك إلا ضعف البصر في الجزء الأحمر من الطيف الضوء). لاستكمال العمل في إنارة الظلام استخدام الأشعة تحت الحمراء (&gt; 800 نانومتر) ، وارتداء نظارات للرؤية الليلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عيون استأصل مع زوج من مقص القزحية المنحنية ونقلها إلى طبق من حل خارج الخلية وضعت تحت مجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القرنية والجسم الهدبي من خلال فتح العين على طول لمبة أورا مشرشر (على الحدود بين الشبكية والجسم الهدبي) مع زوج من مقص الربيع (التي نستخدمها لأول مرة لانسيت اختراق نقطة انطلاق لعدة قطاعات). تأخذ بها العدسة والشبكية منفصلة بعناية من الظهارة الصبغية. إذا كان التوجه للشبكية أمر حاسم لدراستك ، تشير إلى أنه في مثل المرجع [12]. قطع العصب البصري بين شبكية العين والبشرة وإزالة صبغة الشبكية من فنجان العين. لاحظ اتجاه الأسطح الشبكية : داخل الشبكية كرة لولبية من المتابعة هو ganglايون الجانب الخلية ؛ الخارج هو الجانب مبصرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية عن طريق سحب بلطف تشغيله مع المعونة من مسواك خشبي. لهذا الغرض ، واستخدام وحدة تخزين صغيرة من حل خارج الخلية التي تغطي فقط في شبكية العين. ويمكن سحب العصي الزجاجي إلى مسواك وcentrifugally قبالة الشبكية. ثم ، وتطبيق شقوق قصيرة على طول محيط الشبكية لتسهيل التسوية من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكية الى غرفة تسجيل مبصرة ، الجانب السلبي ، تنتشر بها على أسفل الزجاج (نستخدم فرشاة غرامة) ، وذلك مع شل النايلون موتر إطار من الفولاذ المقاوم للصدأ. تعد الثانية في شبكية العين بنفس الطريقة وابقائه في الظلام مكيفة حل carboxygenated خارج الخلية لاستخدامها لاحقا. </li></ol> 2. التسجيلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت غرفة تسجيل في الظلام تحت مجهر المسح الضوئي والليزر تستقيم superfuse إعداد الشبكية باستمرار (لا تقل عن 5 مل / ميلن) مع الحل خارج الخلية carboxygenated تسخينها إلى 35 درجة مئوية. يقع المجهر (مجهزة أيضا مع كاميرا تعمل بالأشعة تحت الحمراء الحساسة CCD) على امتصاص الصدمات الجدول الهواء داخل قفص فاراداي لالتدريع الالكترونية. تغطية القفص مع ستارة غير شفافة للحفاظ على إعدادها في الظلام. نحن أيضا إيقاف شاشة الضوء من شاشات الكمبيوتر التي فيلم شفافة حمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف ليزر الأشعة تحت الحمراء ل850-870 نانومتر أو الموجات الأطول ، والتحول إلى وضع شرط تأمين ، واستخدام اثنين من الفوتون الإثارة لتصور GFP ، معربا عن الخلايا. التخفيف من انتاج الليزر باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة التي تسيطر عليها الليزر برنامج المسح وصولا الى درجة غير كافية لمجرد اعتراف واضح من الخلية الفلورسنت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التصحيح ، المشبك التسجيلات الجاري في وضع الزجاج المشبك micropipettes استخدام (البورسليكات نستخدم أنابيب زجاجية قطرها 1.5 مم الخارجي ، وسمك الجدار 0.225 ملم) مليئة حل الخلايا التي تتكون من (مم) 125 K - غلوكونات ، 10 بوكل ، 0.5 EGTA ، 10 HEPES ، معاير لدرجة الحموضة 7.4 مع KOH (إعطاء المقاومة ماصة من حوالي 5 MΩ). علما أن ظروف تجريبية أخرى مثل الجهد المشبك تسجيل تتطلب حلا مختلفا. إذا المطلوب حقن الصبغة ، إضافة مسبار فلوري (10 ملي نستخدم اليكسا فلور 594) أو جزيء التتبع (3 ٪ Neurobiotin). إدراج micropipette في ماسك وتأكد من أن الإلكترود المرجعي (المكلورة الأسلاك الفضية) في اتصال مع حل خارج الخلية في غرفة تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضغط على micropipette واستهداف GFP ، معربا عن الخلية (نستخدم الغمر بالماء 40 أضعاف الهدف ؛ NA 1.25). وتقع أجسام الخلايا عديم الاستطالات في طبقة الخلايا العقدية (تحت السطح مباشرة في التوجه الحالي في شبكية العين) وكذلك في الجزء القريب من الطبقة النووية الداخلية (حوالي 55-75 ميكرومتر في أعماق الإعداد). قبل micropipette الاتصال مع الخلية المستهدفة ، ويحد من الغشاء الداخلي (غمد مصنوع من endfeet الدبقية) في شبكية العينالسطح يجب أن يكون اخترق. ومن المسلم به الاختراق الناجحة التي قام بها حل الخلايا التي يتم طردهم من طرف micropipette ويفصل الغشاء الداخلي يحد من أنسجة الشبكية الأساسية كما يمكن ملاحظتها على صورة انتقال الأشعة تحت الحمراء التي تلتقطها كاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهج الخلية المطلوبة من خلال مقارنة موقف سوما من صورة ثنائية الفوتون مع صورة للكاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر التي تبين موقف micropipette التسجيل. علما بأن هذه الخطوة لا يتحقق بسهولة ، ويتطلب بعض الممارسة ، لأن الخلية GFP ، معربا عن أن تكون معترف بها في نقل صورة الأشعة تحت الحمراء من أجل توجيه micropipette تجاهها. ويتم تحقيق الاستهداف الصحيح عند الحافة micropipette الأسباب التنقير من سطح الخلية والتي يمكن مشاهدتها في صورة ثنائية الفوتون. بديل لهذا الإجراء ، واستخدام صبغة الفلورسنت (مثل اليكسا فلور 594 ، 100 ميكرون) في حل الخلايا للكشف عن موقف micropipette في صورة ثنائية الفوتون. ثنائي الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء يسمح مضان كافية من هذه الصبغة لجعل micropipette ملحوظ. لهذا الغرض ، وضبط نطاق الكشف في برنامج المسح بالليزر ليشمل أيضا مضان أحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن ضغوط من micropipette والحصول على كامل الخلية التصحيح ، المشبك التكوين في وضع المشبك الجاري. وينبغي أن تعطي تسجيل صالحة للاستعمال إمكانات غشاء -50 إلى -55 بالسيارات ومشاركة ما لا يقل عن 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المثيرات البصرية الحالية إنشاؤها بواسطة برنامج التحفيز (نستخدم QDS التي يولر توماس ، من جامعة توبنغن ، ألمانيا) 11 على جهاز الكمبيوتر. ضبط الموضع المكاني للتحفيز أن تركز على الخلية المسجلة : مارك موقف الخلية تظهر على الشاشة صورة انتقال الكاميرا IR - CCD ومركز حافزا الموضعية مثل على ذلك. ضبط كثافة التحفيز عن طريق إدراج مرشحات الكثافة محايدة في مسار الشعاع. لمعايرة رصد الطيف وكثافة انظر المرجع [14]. اختيار prolongeد interstimulus الفاصل الزمني (على سبيل المثال 15 ق) لتجنب التكيف. وتشمل الضوئي ضمن مسار شعاع للحفاظ على سجل توقيت التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول بدء التحفيز وتسجيل ردود الخفيفة (نستخدم معدل أخذ العينات من 10 كيلوهرتز مع تصفية عند 5 كيلو هرتز لغير التشويك الخلايا ؛ لتسجيل ارتفاع ينصح ارتفاع معدل أخذ العينات مثل 20 كيلو هرتز). استخدام برنامج التحفيز ضوء لتشغيل برنامج تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصبغ ملء السماح للعامل الفلورسنت منتشر في الخلية المسجلة ل30-45 دقيقة قبل أن يتراجع بعناية micropipette من الخلية. الحرص على عدم سحب خلايا الجسم. إذا تم استخدام غير الفلورسنت Neurobiotin التتبع ، فإنها بحاجة إلى التصور من قبل ملزمة لstreptavidin مترافق إلى fluorophore (نستخدم streptavidin - Cy3 ، 1:400 أكثر من ليلة عند 4 درجة مئوية بعد 20 دقيقة من التثبيت بارافورمالدهيد الشبكية ؛ لاقتران صباغة ويمكن إطالة الدراسات streptavidin الحضانة إلى 3 د). بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن يؤديها مع الحقنأقطاب حادة (&gt; 100 MΩ) عندما يتم دفع الصبغة iontophoretically في الخلية مخوزق (البقول مستطيلة : ،25-1 NA ، و 100 مللي ، 100 مللي الفاصل ، مجموع الوقت 3-6 دقائق). </li></ol> 3. ممثل النتائج : النتائج التالية تنشأ من الدراسة على الماوس التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت مروج للهيدروكسيلاز التيروزين 13،14 ، الانزيم تحفيز معدل الحد خطوة في التوليف الكاتيكولامينات (TH : GFP الماوس). استنادا إلى سطوع GFP اشارة المجموعتان خلية متميزة ومميزة (الشكل 2A). خلايا التعبير عن المستوى العالي GFP تمتلك أجسام الخلايا الموجودة في الطبقة النووية الداخلية (INL ، الشكل 2A) أو المشردين في طبقة الخلايا العقدية (GCL ، الشكل 2B) وتطبق في منتصف طبقة ضفيري الداخلية (IPL ، الشكل 2C) . وحددت على أنها خلايا من النوع 2 14-16 ويمكن أن تدرس بشكل منهجي فيما يتعلق مورفولوجيا (الشكل 3) والمنتخبالنشاط rical (الشكل 4) على الرغم من كثافة سكانها سوى مبالغ إلى 250 خلية / مم 2. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> الشكل 1. التمثيل التخطيطي من الإعداد التجريبية. ثنائي الفوتون الإثارة (أحمر مسار الضوء منقط) من fluorophore - معربا عن الخلايا في شبكية العين سليمة تمكن البصرية التي تستهدف من قبل micropipette (مسار الضوء الأخضر الانبعاثات). يتعرض للمؤثرات البصرية الشبكية عبر المكثف المتوقع من المجهر (أصفر مسار الضوء) ، وتسجل ردود ضوء الخلوية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> الشكل 2. GFP ، معربا عن الخلايا في شبكية العين من flatmount TH : GFP الماوس. ويمكن التمييز بين اثنين من السكان من قبل سطوع الإشارات GFP : 1 نوع الخلايا (خلايا DA) الموجود في INL تظهر مضان ضعيفة (A ، انظر السهام) ونوع الخلايا المسمى مكثف 2مع الهيئات الخلية إما في INL (A ، انظر سهام) أو المشردين في GCL (B) والتراتب شجيري في S3 الطبقة من الشعيرات (C). أشرطة النطاق ، 50 ميكرومتر. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> الشكل 3. المورفولوجيا خلية من النوع 2 حقنوا Neurobiotin التتبع. كان تصور التتبع لاحقا من قبل streptavidin - Cy3 ملزمة (قرمزي). ومجهرية ، وهو يصور أيضا إشارة GFP (أخضر) ، هو الإسقاط من مداخن صورة تغطي GCL والشعيرات. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> الشكل 4. ردود ضوء خلية من النوع 2 الموجود في GCL. نمط الاستجابة إلى الأبيض إنارة كامل الحقل ضوء الكثافة المتزايدة في مجموعة ظلامية. ويرد في كثافة التحفيز photoisomerizations في قضيب في الثانية الواحدة (ره * / قضيب / ثانية). تم استخدام التحفيز لفترات طويلة من 3 ليالي لأفضل متميزةايون من مكونات الاستجابة عند بدء التحفيز (ON الاستجابة) ويقابلها (إيقاف الاستجابة).

<ol>
	<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+plan+of+the+retina.">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li><li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry.">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells.">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Jackson, M. B., Gerfen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+voltage+clamp+recording.">Whole-cell voltage clamp recording.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (1997).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pf&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li><li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , (2005).</li><li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li><li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li><li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice.">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li><li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina.">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li><li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina.">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla M&#252;ller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina.">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li><li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

وقد تم التعامل مع الفئران والموت الرحيم وفقا لمبادئ توجيهية مؤسسية لرعاية الحيوان والقوانين المتعلقة التجارب على الحيوانات التي تصدرها الحكومة الألمانية.

هذا الأسلوب يتيح إمكانية لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية المحددة في الشبكية سليمة تحت إشراف البصرية دون التأثير على حالة adaptational الشبكية. هي مناسبة خاصة وأنها لتوصيف الخلايا التي هي في الوقت الحاضر بدلا درس سيئة بسبب الكثافة السكانية المنخفضة مثل معظم السكان من الخلايا عديم الاستطالات. ثنائي الفوتون الإثارة تصاريح التصوير عالية الدقة وعالية التباين ، وحتى من أعمق أجزاء من الأنسجة 17 ، شرطا مسبقا لاستهداف دقيقة وناجحة التصحيح - لقط من خلايا خاصة في INL مع كثافة عالية من الهيئات الخلية. شبكية العين هي معزولة الماوس قابلة للح 3-4 في ظل الظروف التجريبية. إذا تم تخزين شبكية العين الثانية في ظلام دامس تحت بالغاز كربوجين مستمرة ، فإنه يحتفظ اللون الأرجواني من صباغ متبدل بالضوء غير المبيض ، ويمكن استخدامها بعد الانتهاء من التجارب على شبكية العين الأولى. في البداية ، واستهدافالخلية المحددة مع micropipette wholemount في شبكية العين قليلا تحديا ويتطلب بعض الممارسة ، وخصوصا عندما تعمل في الظلام. يمكن بما في ذلك صبغة الفلورسنت في micropipette تبسيط الإجراءات ، وذلك لأن الخلية وmicropipette مرئية تحت ثنائية الفوتون الإثارة في نفس الوقت. ومع ذلك ، قد إضافة مكونات إلى حل بين الخلايا يعرقل تشكيل gigaseal أو التسبب في جودة التسجيل للمعاناة. مرة واحدة حققت بنجاح ، يمكن تسجيل جيدة للمشاركة حوالي 1 ساعة. في حين أن ضوء الأشعة تحت الحمراء هي سيئة الإثارة فقط استوعبت نفسها مبصرات الشبكية ، متحمس GFP - معربا عن الخلايا ينبعث الضوء في الجزء المرئي من الطيف. ومع ذلك ، نحن متحمسون fluorophores فقط في حجم تنسيق والصغيرة التي ليس من المرجح أن تغير الشرط adaptational من شبكية العين. وهناك حاجة فقط عن أكثر ، والإثارة لاستهداف ويمكن مغلقا خلال تسجيل الاستجابات الخفيفة. وusefulnويتجلى بالفعل وفاق سطيف لهذا النهج من الدراسات على فئات معينة من السكان من الخلايا التي عديم الاستطالات 14،18 من التسجيلات الكهربية لولاها لكان ممكنا فقط عن طريق الصدفة 12. أخيرا ، يمكن أيضا أن تكون هذه التقنية القوية التي تقدمها بما في ذلك اتباع نهج الدوائية 14 ، كا 2 + 19 أو التصوير باستخدام خلايا حقن للدراسات immunocytochemical أو المجهر الإلكتروني. بهذه الطريقة ، يمكن كشف موقف الوظيفية من نوع خلية معينة في الدوائر الشبكية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> كاشف / جهز السالح </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> نظارات للرؤية الليلية </td><td> Gutzeit محدودة ، Warthausen وألمانيا </td><td> Xtron F1 </td><td> يتضمن مصدر الضوء 800 نانومتر </td></tr><tr><td> تصفية البصرية </td><td> شوت ، ماينز ، ألمانيا </td><td> RG9 </td><td> longpass فلتر مع قطع تبلغ 690 نانومتر </td></tr><tr><td> مقص القزحية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 14061-09 </td><td> منحني مع النصل 22 مم </td></tr><tr><td> مقص الربيع </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 15000-00 </td><td> مستقيم مع شفرة 3 ملم </td></tr><tr><td> غرفة تسجيل </td><td> وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا </td><td> 200-100 500 0180 نوع A (TC) </td><td> تفلون مع غرفة أسفل محمولة على الزجاج زلة تغطية (حوالي 0.15 ملم ، 500 رقم 0182 200-100) </td></tr><tr><td> تدفق سخان </td><td> نظم متعددة ، ريوتلنجن وألمانيا </td><td> PH01 ، TC01 </td><td> مع صفيحة تسخين قنية التروية مع درجة الحرارة لياليودرجة الحرارة وحدة تحكم إنسور </td></tr><tr><td> مجهر المسح الضوئي ليزر </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td> DM LFS </td><td> متحد البؤر التي تسيطر عليها برامج لايكا </td></tr><tr><td> الجدول الهواء </td><td> نيوبورت </td><td> VH - 3036W الأراضي الفلسطينية المحتلة </td><td></td></tr><tr><td> الليزر </td><td> الأطياف ، الفيزياء </td><td></td><td> الوضع غير الساحلية تسونامي تي : ليزر الياقوت </td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> AG PCO ، Kelheim وألمانيا </td><td> PixelFly QE </td><td> بما في ذلك البرمجيات السيطرة </td></tr><tr><td> Micropipette الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> Hilgenberg ، Malsfeld وألمانيا </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette مجتذب </td><td> سوتر الصك </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا فلور 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 20004 </td><td> صبغة الفلورسنت </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC - SP - 1120 - M050 </td><td> غير الفلورسنت التتبع </td></tr><tr><td> Streptavidin - Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> هيئة التصنيع العسكريromanipulator </td><td> وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> بمحركات Mini25 حدة تتلاعب مع عرض SM - 5 </td></tr><tr><td> التصحيح ، المشبك مكبر للصوت </td><td> NPI الإلكترونية محدودة ، تام ، ألمانيا </td><td> SEC - 05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> التحويل الرقمي </td><td> الصكوك الوطنية </td><td> BNC - 2090 </td><td></td></tr><tr><td> الحصول على البيانات البرمجيات WinWCP </td><td> جون ديمبستر ، جامعة اسكتلندا ، غلاسكو ، المملكة المتحدة </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS التحفيز البصري مولد </td><td> توماس أويلر ، جامعة توبنغن في ألمانيا </td><td></td><td> يجب أن تعمل على كمبيوتر منفصل التحكم 2 مراقبين (واجهة المستخدم ، ورصد الحوافز) </td></tr><tr><td> مرشحات الكثافة محايدة </td><td> ITOS ، ماينز ، ألمانيا </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

دراسة الخصائص الفيزيولوجية واتصالات متشابك معينة من الخلايا العصبية في أنسجة سليمة يشكل تحديا لتلك الخلايا التي تفتقر إلى السمات المورفولوجية واضح أو إظهار كثافة السكانية المنخفضة. هذا ينطبق بشكل خاص على الخلايا الشبكية عديم الاستطالات ، وهي فئة استثنائية في interneurons المتعددة الأشكال والتي تضم ما يقرب من 30 في الثدييات فرعية 1. على الرغم من كونها جزءا مهما من معالجة البصرية من خلال وضع الإخراج الشبكية 2 ، لم تكن معظم هذه الأنواع الفرعية درست حتى الآن في سياق وظيفي لمواجهة هذه الخلايا مع القطب تسجيل هو حدث نادر. في الآونة الأخيرة ، عدد كبير من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تتوفر علامات التعبير عن بروتين فلوري مثل الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت سيطرة المروجين لمستقبلات الغشاء أو الانزيمات التي هي محددة لمجموعة فرعية فقط من الخلايا العصبية في نسيج معين 3،4. هذه الخلايا ما قبل المسمى بالتالي فهي accessibl<html> ه لتوجيه microelectrode استهداف تحت السيطرة المجهرية ، والسماح للدراسة منهجية خصائصها الفسيولوجية في الموقع. ومع ذلك ، ويرافق إثارة علامات الفلورسنت من خطر الضيائية للأنسجة الحية. في شبكية العين ، ويعوق هذا النهج بالإضافة إلى المشكلة التي تسبب الإثارة ضوء التحفيز المناسب للمبصرات مما كبد صباغ متبدل بالضوء تبيض ونقل الدوائر الشبكية في حالة الضوء مكيفة. يتم التغلب على هذه العوائق باستخدام الأشعة تحت الحمراء الإثارة التي تقدمها ليزر وضع تخوض نبضات قصيرة من نطاق الفيمتو ثانية. الإثارة ثنائي الفوتون يوفر طاقة كافية لاستثارة fluorophore ، وفي الوقت نفسه يحد من الإثارة إلى وحدة تخزين صغيرة الأنسجة التقليل من مخاطر photodamage 5. أيضا ، فإنه يترك الشبكية تستجيب لمحفزات بصرية منذ ضوء الأشعة تحت الحمراء (&gt; 850 نانومتر) هو ضعيف فقط تمتصه photopigments 6. ق = &quot;jove_content&quot;&gt; نحن في هذه المقالة لشرح استخدام الفأرة في شبكية العين وراثيا لتحقيق الكهربية في تسجيلات الموقع من GFP ، معربا عن الخلايا التي يتم استهداف بصريا من قبل اثنين من الفوتون الإثارة. مستعدة شبكية العين والمحافظة عليها في الظلام ويمكن أن يتعرض للمؤثرات الضوئية التي يتوقع عبر المكثف من المجهر (الشكل 1). ويمكن الجمع بين التصحيح ، المشبك تسجيل الاستجابات ضوء صبغ مع ملء الكشف عن التشكل وصبغ للتحقق من مفرق بوساطة الفجوة اقتران إلى الخلايا المجاورة ، بحيث يمكن دراستها من قبل الخلية الهدف على مستويات مختلفة التجريبية.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina at JoVE.com

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

هذا المقال يصور تسجيل الخلايا العصبية الفردية من السكان الموسومة fluorescently في الشبكية الماوس سليمة. باستخدام اثنين الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء تم استهداف الخلايا المسمى transgenetically عن التصحيح ، المشبك تسجيل لدراسة ردودهم الخفيفة ، وخصائص الحقل تقبلا ، والتشكل.

توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

عضوي النمط من الثقافة شريحة GFP - معربا عن أجنة الفئران لريال مدريد في الوقت ثمرة تصوير الأعصاب الطرفية

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

توصيف نسيجية سليمة من الأجهزة بالغة الصغر زرع الدماغ والأنسجة المحيطة بها

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المستقبلات الضوئية

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

في المختبر توصيف الخصائص الكهربية لألياف الزبائ Colonic في الفئران

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...