Name: electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 til KD og RW). Vi er taknemmelige for Thomas Euler (Töbingen, Tyskland) for lyset stimulation software QDs.

Følgende beskrivelse forudsætter, at forsøgslederen har en grundlæggende forståelse af retinal struktur, patch-clamp optagelse, og to-foton mikroskopi. For nyttige oplysninger om oprettelse og drift af en patch-clamp setup og to-foton imaging system, se Refs [7-12]. 1. Dyre-og væv forberedelse <ol><li> Hold musen mørk-tilpasset i mindst 3 timer I mellemtiden forbereder 1-2 L af ekstracellulært løsning bestående af (i mm) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucose og tempereres det til pH 7,4 ved gasning med carbogen (5% CO 2 i O 2) ved stuetemperatur. </li> en <li> Aflive musen i en lufttæt kammer ved CO 2 overdosis fulgt af dislokation af halsen. Denne procedure og de følgende trin skal udføres i mørke. Brug dim lang bølgelængde belysning (vi blokere korte bølgelængder fra en kold lyskilde med en 690 nm-longpass filter) til at understøtte personlige vision og samtidig holde dyrets øjne, mørk-tilpasset (mus kun har dårligt syn i den røde del af lysspektret). For arbejde i fuldstændig mørke bruge infrarød belysning (&gt; 800 nm) og slid natkikkerter. </li><li> Enucleate øjne med et par af buede iris saks og overføre dem til en parabol af ekstracellulært løsning henført under en dissektionsmikroskop. </li><li> Fjern hornhinden og corpus ciliare ved at åbne øjet pæren langs ORA serrata (grænsen mellem nethinden og corpus ciliare) med et par af forårets sakse (vi først bruge en lancet til at gennembore et udgangspunkt for skæring). Tag linsen og omhyggeligt adskilt nethinden fra pigment epitel. Hvis orienteringen af ​​nethinden er afgørende for dit studie, viser det ligesom i Ref. [12]. Skær den optiske nerve mellem nethinden og pigment epitel og fjern nethinden fra øjestykket. Bemærk retningen af ​​retinal overflader: indersiden af ​​kruset op nethinden er den ganglion celle side, ydersiden er fotoreceptor side. </li><li> Tag glaslegemet fra den indre nethinde overfladen ved forsigtigt at trække det ud ved hjælp af en træ-tandstikker. Til dette formål skal du bruge en lille mængde ekstracellulært løsning, der netop dækker nethinden. Den glasagtige klæber til tandstikker og kan trækkes centrifugalt væk fra nethinden. Derefter gælder korte snit langs retinale perimeter at lette udfladning af vævet. </li><li> Overfør nethinden af ​​kontrolapparatet kammer fotoreceptor nedad, bredte det ud på glasbund (vi bruger en fin pensel) og immobilisere den med en nylon-overspændte stel af rustfrit stål. Forbered den anden nethinden på samme måde, og holde det mørke-tilpasset i carboxygenated ekstracellulære løsning til senere brug. </li></ol> 2. Optagelser <ol><li> Installer optagelsen kammer i mørke under en opretstående laser scanning mikroskop og superfuse den retinale præparatet kontinuerligt (ikke mindre end 5 ml / min) med carboxygenated ekstracellulære løsning opvarmet til 35 ° C. Mikroskopet (også udstyret med en infrarød-følsom CCD-kamera) er beliggende på en stødabsorberende luft bord inde i et Faradays bur for elektronisk afskærmning. Dæk buret med et ikke-transparent gardin til at holde forberedelse i mørket. Vi har også skærmen slukket lyset fra computerskærme med røde gennemsigtig film. </li><li> Tune den infrarøde laser til 850-870 nm eller længere bølgelængder, skifte til mode-locked stand, og bruge to-foton excitation at visualisere GFP-udtrykkende celler. Dæmpe laser-udgang via neutralfiltre kontrolleret af laser scanning software ned i en grad, der netop er tilstrækkeligt til klar anerkendelse af den fluorescerende cellen </li><li> For patch-clamp-optagelser i løbende klemme tilstand brug glas mikropipetter (vi bruger borosilikatglas slange på 1,5 mm udvendig diameter og 0,225 mm vægtykkelse) fyldt med intracellulær løsning bestående af (i mm) 125 K-gluconat, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titreret til pH 7,4 med KOH (hvilket giver en pipette modstand på omkring 5 MOhm). Bemærk, at andre eksperimentelle betingelser gerne spændings-clamp optagelse kræver en anden løsning. Hvis farvestoffet injektioner ønskes, tilsættes et fluorescerende probe (vi bruger 10 mM Alexa Fluor 594) eller et sporstof molekyle (3% Neurobiotin). Sæt mikropipette i holderen, og sørg for, at henvisningen elektrode (chlorerede sølv tråd) er i kontakt med den ekstracellulære løsning i optagelsen kammeret. </li><li> Påfør tryk på mikropipette og målrette en GFP-udtrykkende celler (vi bruger en 40-fold nedsænkning i vand mål; NA 1.25). Amacrine celle organer er beliggende i ganglion cellelag (lige under overfladen i den nuværende retning af nethinden) samt i den proximale del af den indre nukleare lag (ca. 55-75 μm dybt inde i forberedelse). Før mikropipette kontakt med målrettet celle, den indre begrænser membran (en kappe lavet af glial endfeet) på nethindenOverfladen skal være trængt ind. Vellykket penetration af intracellulære løsning, der er drevet ud fra mikropipette spids og løsner den indre begrænser membran fra det underliggende retinal væv som kan iagttages på en infrarød transmission, der optages via IR-CCD-kamera. </li><li> Approach den ønskede celle ved at sammenligne Soma position fra den to-foton billede med billedet af den IR-CCD-kamera, der viser placeringen af ​​optagelsen mikropipette. Bemærk, at dette skridt ikke opnås nemt og kræver lidt øvelse, fordi den GFP-udtrykkende celler er at blive anerkendt i den infrarøde transmission billedet for at dirigere mikropipette mod det. Korrekt målretning er nået, når mikropipette spidsen årsager indtrækninger af cellens overflade, der kan ses i de to-foton billede. Alternativ til denne procedure, bruge en fluorescerende farvestof (f.eks Alexa Fluor 594, 100 mM) i den intracellulære løsningen til at afsløre mikropipette position i de to-foton billede. To-foton infrarød excitation giver mulighed for tilstrækkelig fluorescens af dette farvestof for at gøre mikropipette mærkbar. Til dette formål, justere detektionsområdet i laser scanning software til også at omfatte rød fluorescens. </li><li> Slip pres fra mikropipette og få en hel-celle patch-clamp-konfiguration i løbende klemme tilstand. En brugbar optagelse skal give en membran potentiale for -50 til -55 mV og sidste i mindst 20 min. </li><li> Nuværende visuelle stimuli skabt af en stimulation software (vi bruger QDs af Thomas Euler, University of Tübingen, Tyskland) 11 på en computerskærm. Juster den rumlige position stimulation til at være centreret på de optagede celle: Marker cellen position på skærmen viser transmissionen billede af IR-CCD-kamera og centrum en spot-lignende stimulus på det. Tune stimulus intensiteten ved at indsætte neutralfiltre ind i strålegangen. Til kalibrering af skærm spektrum og intensitet se ref [14]. Vælg et prolonged interstimulus interval (fx 15 s) for at undgå tilpasning. Medtag en fotodiode i strålegangen for opbevaring af stimulus timing. </li><li> Start stimulering protokollen og registrere lys svarene (vi bruger en samplingfrekvens på 10 kHz med filtrering på 5 kHz for ikke-spiking celler, for spike optagelse af en højere samplingfrekvens som 20 kHz anbefales). Brug lyset stimulation software til at udløse optagelsen software. </li><li> For farvestof påfyldning lad fluorescerende stof diffunderer ind i indspillet cellen i 30-45 minutter før omhyggeligt hydrauliske mikropipette fra cellen. Pas på ikke at trække sig ud af cellen kroppen. Hvis det ikke-fluorescerende tracer Neurobiotin blev brugt, den har brug for visualisering ved at binde sig til streptavidin konjugeret til et fluoroforen (vi bruger streptavidin-Cy3, 1:400 natten over ved 4 ° C efter 20 min paraformaldehyd fiksering af nethinden, for dye-kobling undersøgelser streptavidin inkubationen kan forlænges til 3 d). Alternativt kan injektioner også udføres medskarpe elektroder (&gt; 100 MOhm), når farvestoffet er drevet iontophoretically i spiddet celle (rektangulære pulser: 0,25-1 NA, 100 ms, interval 100 ms, samlet tid 3-6 min). </li></ol> 3. Repræsentative resultater: Følgende resultater stammer fra en undersøgelse på en mus udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under promotor for tyrosin hydroxylase 13,14, det enzym, der katalyserer det hastighedsbegrænsende trin i katekolamin syntese (TH:: GFP mus). Baseret på lysstyrken på GFP-signalet to forskellige cellepopulationer kan skelnes fra hinanden (Figur 2A). Celler, der udtrykker det højere GFP-niveau besidder celle, der er beliggende i den indre nukleare lag (INL, figur 2A) eller fordrevne i ganglion cellelag (GCL, figur 2B) og stratificere i midten af ​​den indre plexiform lag (IPL, figur 2C) . De blev identificeret som type 2-celler 14-16 og kunne systematisk undersøgt med hensyn til morfologi (Figur 3) og vælgerrical aktivitet (Figur 4) selv om dens befolkningstæthed kun beløber sig til 250 celler / mm 2. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> Figur 1. Skematisk fremstilling af forsøgsopstillingen. To-foton excitation (rød stiplet lys sti) for fluoroforen-udtrykkende celler i den intakte nethinden giver visuelle målretning af en mikropipette (grøn emission lys sti). Nethinden er udsat for optisk stimuli projekterede gennem kondensatoren til mikroskop (gult lys sti), og cellulære lette svar er registreret. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> Figur 2. GFP-udtrykkende celler i en retinal flatmount af en TH:: GFP mus. To populationer kan skelnes ved at lysstyrken på GFP-signal: type 1-celler (DA celler) ligger i INL viser svag fluorescens (A, se pilespidser) og intenst mærkede type 2-cellermed celle organer, enten i INL (A, se pile) eller fordrevne i GCL (B) og en dendritiske lagdeling i stratum S3 af IPL (C). Skala barer, 50 μm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> Figur 3. Morfologi af en type 2-celler injiceret med sporstof Neurobiotin. Det sporstof blev efterfølgende visualiseret ved streptavidin-Cy3 bindende (magenta). De mikrograf, som også skildrer GFP signal (grøn), er en projektion af Billedstakke dækker GCL og IPL. Skala bar, 50 μm. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> Figur 4. Light svar af en type 2-celle placeret i GCL. Reaktionsmønster til hvidt lys fuld-field belysning af stigende intensitet i scotopic området. Stimulus intensitet er givet i photoisomerizations pr stang per sekund (Rh * / stang / s). En forlænget stimulus på 3 s blev brugt til bedre adskillerion af reaktionen komponenter på stimulus debut (ON respons) og offset (OFF respons).

<ol>
	<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+plan+of+the+retina.">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li><li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry.">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells.">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Jackson, M. B., Gerfen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+voltage+clamp+recording.">Whole-cell voltage clamp recording.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (1997).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pf&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li><li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , (2005).</li><li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li><li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li><li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice.">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li><li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina.">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li><li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina.">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla M&#252;ller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina.">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li><li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

Musene blev håndteret og aflives i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for dyrevelfærd og love om dyreforsøg, der er udstedt af den tyske regering.

Denne metode giver mulighed for at studere elektriske egenskaber af specifikke neuroner i den intakte nethinden under visuel vejledning uden at påvirke tilpasnings tilstand af nethinden. Det er specielt velegnet til karakterisering af celler, der i øjeblikket er temmelig dårligt undersøgt på grund af lav befolkningstæthed som de fleste populationer af amacrine celler. To-foton excitation giver høj opløsning og høj kontrast imaging selv fra dybere dele af vævet 17, en forudsætning for præcis målretning og vellykket patch-fastspænding af celler især i de INL med sin høje tæthed af celle organer. Den isolerede musen nethinden er rentabelt for 3-4 timer under eksperimentelle betingelser. Hvis den anden nethinden er gemt i komplet mørke under konstant carbogen gasning, bevarer den lilla farve ubleget photopigment og kan bruges efter endt forsøg med den første nethinden. I begyndelsen, rettet modvalgte celle med mikropipette i retinal wholemount er en smule udfordrende og kræver lidt øvelse, især når der arbejdes i mørke. Herunder et fluorescerende farvestof i mikropipette kan forenkle proceduren, fordi celle og mikropipette er synlige under to-foton excitation på samme tid. Dog kan tilføje komponenter til den intracellulære løsning hindre gigaseal dannelse eller forårsage optagelsen kvalitet til at lide. Når succes opnået, kan en god optagelse, der sidst i ca 1 time Der henviser til, infrarøde excitation lys i sig selv er kun i ringe grad absorberes af retinal fotoreceptorer, ophidset GFP-udtrykke celler udsender lys i den synlige del af spektret. Dog er fluorophores begejstrede kun i et lille omdrejningspunkt volumen, der ikke er sandsynligt, at ændre tilpasnings tilstand af nethinden. Alle de mere, magnetisering er kun nødvendig for at målrette og kan slukkes under optagelse af lys svar. Den usefulnESS af denne fremgangsmåde er allerede bevist ved undersøgelser af specifikke populationer af amacrine celler 14,18 hvorfra elektrofysiologiske optagelser ellers ville have været muligt blot ved et uheld 12. Endelig kan denne kraftfulde teknik, yderligere udvides ved at inkludere en farmakologisk tilgang 14, Ca 2 + imaging 19 eller ved at bruge injiceres celler til immuncytokemiske studier eller elektronmikroskopi. På den måde kan den funktionelle placering af en given celletype i retinale kredsløb blive bragt i orden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens / udstyr </th><th> Firma </th><th> Katalog nummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Night-vision goggles </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Tyskland </td><td> Xtron F1 </td><td> omfatter en 800 nm lyskilde </td></tr><tr><td> Optisk filter </td><td> Schott, Mainz, Tyskland </td><td> RG9 </td><td> longpass filter med cutoff på 690 nm </td></tr><tr><td> Iris saks </td><td> Fin Science Tools </td><td> 14061-09 </td><td> buet med 22 mm klinge </td></tr><tr><td> Spring saks </td><td> Fin Science Tools </td><td> 15000-00 </td><td> lige med 3 mm klinge </td></tr><tr><td> Optagelse kammer </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Tyskland </td><td> 200-100 500 0180 type A (TC) </td><td> Teflon kammer med bottom-monteret glas dække slip (ca. 0,15 mm; nr. 200 til 100 500 0182) </td></tr><tr><td> Gennemstrømningsvarmelegeme </td><td> Multichannel Systems, Reutlingen, Tyskland </td><td> PH01, TC01 </td><td> kunne opvarmes perfusion kanyle med temperatur sEnsor og temperatur controller </td></tr><tr><td> Laser scanning mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> kontrolleret af Leica Konfokal Software </td></tr><tr><td> Air tabel </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Tsunami Mode-låst Ti: safir laser </td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> PCO AG, Kelheim, Tyskland </td><td> PixelFly QE </td><td> herunder kontrol software </td></tr><tr><td> Mikropipette glas kapillærer </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Tyskland </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipette aftrækker </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> fluorescerende farvestof </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> ikke-fluorescerende tracer </td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Tyskland </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motoriseret Mini25 manipulator enhed med display SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-clamp forstærker </td><td> NPI electronic GmbH, Tamm, Tyskland </td><td> SEC-05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> Dataopsamlingssoftware WinWCP </td><td> John Dempster, University of Scotland, Glasgow, Storbritannien </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> Visuelle stimulus generator QDs </td><td> Thomas Euler, University of Tübingen, Tyskland </td><td></td><td> skal drives på en separat computer kontrollerende 2 skærme (brugergrænseflade, stimulus skærm) </td></tr><tr><td> Neutralfiltre </td><td> ITOS, Mainz, Tyskland </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

Undersøgelse af fysiologiske egenskaber og synaptiske forbindelser af specifikke neuroner i den intakte væv er en udfordring for de celler, der mangler synlige morfologiske træk eller vise en lav befolkningstæthed. Dette gælder især for retinal amacrine celler, en usædvanlig mangeartet klasse af interneuroner, der udgør omkring 30 undertyper i pattedyr 1. Skønt at være en afgørende del af den visuelle behandling af forme retinale udgang 2, har de fleste af disse undertyper ikke blevet undersøgt indtil nu i en funktionel sammenhæng, fordi støder på disse celler med en optagelse elektrode er en sjælden begivenhed. For nylig, et væld af transgene mus linjer er til rådighed, der udtrykker fluorescerende markører som grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af initiativtagerne til membran receptorer eller enzymer, som er specifikke for kun en delmængde af neuroner i et givet væv 3,4. Disse pre-mærkede celler er derfor accessible til instrueret mikroelektrode målrette under mikroskopiske kontrol, således at den systematiske undersøgelse af deres fysiologiske egenskaber in situ. Imidlertid er excitation af fluorescerende markører ledsaget af risikoen for fototoxicitet for det levende væv. I nethinden, er denne tilgang yderligere vanskeliggjort af det problem, at excitation lys forårsager passende stimulering af fotoceller, således at påføre photopigment blegning og overføre den retinale kredsløb i et let-tilpasset tilstand. Disse ulemper er overvundet ved hjælp af infrarød excitation leveret af en mode-locked laser i korte pulser af femtosekund rækkevidde. To-foton excitation giver energi nok til fluoroforen excitation og samtidig begrænser irritation til et lille væv volumen minimering af farerne af solskader 5. Også, det forlader nethinden lydhør over for visuelle stimuli siden infrarødt lys (&gt; 850 nm) er kun i ringe grad absorberes af photopigments 6. in situ optagelser fra GFP-udtrykkende celler, der visuelt målrettet af to-foton excitation. Nethinden er udarbejdet og vedligeholdes i mørke og kan blive udsat for optisk stimuli som forventes gennem kondensatoren til mikroskop (figur 1). Patch-clamp optagelse af lys reaktioner kan kombineres med farvestof påfyldning at afsløre morfologi og at kontrollere for gap junction-medierede dye kobling til de omkringliggende celler, således at målet celle kan ved studeres på forskellige eksperimentelle niveauer.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina at JoVE.com

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Denne artikel viser optagelsen af ​​de enkelte celler fra fluorescens tagget neuronale populationer i det intakte mus nethinden. Ved at bruge to-foton infrarøde excitation transgenetically mærkede celler var målrettet til patch-clamp-optagelse for at studere deres lette svar, modtagelige feltegenskaber, og morfologi.

Elektrofysiologiske Karakterisering af GFP-udtrykkende cellepopulationer i den intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk Karakterisering af Brain-implanterede Microdevices og det omgivende væv

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiske optagelse i hjernen af ​​intakte Voksen Zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Vurdering af Vascular Regeneration i CNS Brug af musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dybdegående Fysiologisk Analyse af Definerede Cell populationer i Akut Tissue Skiver af Mouse vomeronasale organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Udarbejdelse af horisontale Skiver af Voksen Mouse Retina for Elektrofysiologiske Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrofysiologisk metode til hele celle spænding clamp optagelser fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Karakterisering af de elektrofysiologiske egenskaber af Colon afferente fibre i rotter

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...