Name: electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00
Duration: 7 min 30 s
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यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (केडी और आरडब्ल्यू के लिए WE849/16 1 / 2) द्वारा समर्थित किया गया. हम प्रकाश उत्तेजना सॉफ्टवेयर QDs के लिए थॉमस यूलर (Töbingen जर्मनी) के लिए आभारी हैं.

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चूहे को संभाला और पशु कल्याण के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों और जर्मन सरकार द्वारा जारी किए गए पशु प्रयोगों पर कानून के अनुसार में euthanized थे.

इस विधि दृश्य मार्गदर्शन के अंतर्गत बरकरार रेटिना में विशिष्ट न्यूरॉन्स की रेटिना की adaptational हालत को प्रभावित किए बिना बिजली के गुणों का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है. यह विशेष रूप से कोशिकाओं है कि वर्तमान में कर रहे हैं बल्कि खराब लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं के अधिकांश आबादी की तरह कम जनसंख्या घनत्व के कारण अध्ययन के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है. दो photon उत्तेजना में 17 ऊतक के गहरे भागों, सटीक लक्ष्यीकरण के लिए एक शर्त और सफल पैच clamping सेल निकायों के उच्च घनत्व के साथ लीग में विशेष रूप से कोशिकाओं की. से भी उच्च संकल्प और उच्च विपरीत इमेजिंग परमिट पृथक माउस रेटिना प्रयोगात्मक शर्तों के तहत 3-4 घंटे के लिए व्यवहार्य है. अगर दूसरा रेटिना निरंतर carbogen बक के तहत पूरी तरह अंधेरे में संग्रहीत किया जाता है, यह कड़ा photopigment के बैंगनी रंग बरकरार रखती है और पहली रेटिना के प्रयोगों के साथ खत्म करने के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. शुरुआत में, लक्ष्यीकरणरेटिना wholemount में micropipette के साथ चयनित कक्ष एक चुनौतीपूर्ण सा है और कुछ अभ्यास की आवश्यकता है है, खासकर जब अंधेरे में काम. Micropipette में एक फ्लोरोसेंट रंजक शामिल प्रक्रिया को सरल बनाने, क्योंकि सेल और micropipette एक ही समय में दो photon उत्तेजना के तहत दिखाई दे रहे हैं कर सकते हैं. हालांकि, intracellular समाधान के लिए घटकों को जोड़ने gigaseal गठन में बाधा या रिकॉर्डिंग गुणवत्ता पीड़ित करने के लिए कारण हो सकता है. एक बार सफलतापूर्वक हासिल की है, एक अच्छा रिकॉर्डिंग के बारे में 1 एच. के लिए पिछले कर सकते हैं अवरक्त उत्तेजना प्रकाश जबकि खुद ही खराब रेटिना photoreceptors के द्वारा अवशोषित है, उत्साहित GFP-व्यक्त कोशिकाओं स्पेक्ट्रम के दृश्य भाग में प्रकाश फेंकना. हालांकि, fluorophores कि रेटिना की adaptational हालत बदलने की संभावना नहीं है एक छोटे फोकल मात्रा में ही उत्साहित कर रहे हैं. सभी अधिक उत्तेजना, केवल लक्षित करने के लिए की जरूरत है और प्रकाश प्रतिक्रियाओं का रिकॉर्डिंग के दौरान बंद किया जा सकता है. usefulnइस दृष्टिकोण का ईएसएस पहले से ही लंबे प्रबर्धों से रहित 14,18 कोशिकाओं जिसमें से electrophysiological रिकॉर्डिंग अन्यथा केवल 12 दुर्घटना के द्वारा संभव हो गया होगा की विशिष्ट आबादी पर अध्ययन के द्वारा प्रदर्शन किया है . अंत में, इस शक्तिशाली तकनीक के आगे एक औषधीय दृष्टिकोण 14, 2 Ca + 19 इमेजिंग सहित द्वारा या immunocytochemical अध्ययन या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इंजेक्शन कोशिकाओं का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है. इस तरह, रेटिना circuitry में एक दिया सेल प्रकार के कार्यात्मक स्थिति को सुलझाया जा सकता है.

<table border="1"><tbody><tr><th> अभिकर्मक / लैस बयान </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th><th> टिप्पणियाँ </th></tr><tr><td> रात दृष्टि काले चश्मे </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, जर्मनी </td><td> Xtron F1 </td><td> 800 एनएम प्रकाश स्रोत शामिल </td></tr><tr><td> ऑप्टिकल फिल्टर </td><td> Schott, Mainz, जर्मनी </td><td> RG9 </td><td> cutoff के साथ 690 एनएम पर फ़िल्टर longpass </td></tr><tr><td> आईरिस कैंची </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 14061-09 </td><td> 22 मिमी ब्लेड के साथ घुमावदार </td></tr><tr><td> स्प्रिंग कैंची </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 15000-00 </td><td> सीधे 3 मिमी ब्लेड के साथ </td></tr><tr><td> रिकॉर्डिंग कक्ष </td><td> Luigs और Neumann GmbH, Ratingen, जर्मनी </td><td> 200-100 500 0180 प्रकार एक (टीसी) </td><td> नीचे लगे हुए गिलास को कवर पर्ची के साथ Teflon कक्ष (लगभग 0.15 मिमी, सं 200-100 500 0182) </td></tr><tr><td> फ्लो हीटर </td><td> Multichannel सिस्टम, Reutlingen, जर्मनी </td><td> TC01 PH01 </td><td> तापमान एस के साथ heatable छिड़काव प्रवेशनीensor और तापमान नियंत्रक </td></tr><tr><td> लेजर खुर्दबीन स्कैनिंग </td><td> Leica माइक्रोसिस्टम्स </td><td> डीएम LFS </td><td> Leica Confocal सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित </td></tr><tr><td> एयर तालिका </td><td> न्यूपोर्ट </td><td> VH 3036W - ऑप्ट </td><td></td></tr><tr><td> लेज़र </td><td> स्पेक्ट्रा - भौतिकी </td><td></td><td> सुनामी मोड बंद तिवारी: नीलमणि लेजर </td></tr><tr><td> सीसीडी कैमरा </td><td> पीसीओ एजी, Kelheim, जर्मनी </td><td> PixelFly QE </td><td> नियंत्रण सॉफ्टवेयर सहित </td></tr><tr><td> Micropipette कांच capillaries </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, जर्मनी </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette डांड़ी </td><td> Sutter साधन </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> एलेक्सा 594 Fluor </td><td> Invitrogen </td><td> एक - 20,004 </td><td> फ्लोरोसेंट रंजक </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> कुलपति सपा-1120-M050 </td><td> गैर - फ्लोरोसेंट ट्रेसर </td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs और Neumann GmbH, Ratingen, जर्मनी </td><td> 210-100 0010 000 </td><td> Mini25 जोड़तोड़ के साथ इकाई motorized प्रदर्शन एस.एम. - 5 </td></tr><tr><td> पैच - क्लैंप प्रवर्धक </td><td> NPI इलेक्ट्रॉनिक GmbH, Tamm, जर्मनी </td><td> एसईसी-05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> अंकरूपक </td><td> नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर WinWCP </td><td> जॉन Dempster, स्कॉटलैंड, ग्लासगो, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / / sipbs software.htm </td></tr><tr><td> दृश्य उत्तेजना जनरेटर QDs </td><td> थॉमस यूलर, विश्वविद्यालय के Tübingen, जर्मनी </td><td></td><td> 2 पर नज़र रखता है (उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस, उत्तेजना की निगरानी) को नियंत्रित एक अलग कंप्यूटर पर संचालित किया जाना है </td></tr><tr><td> तटस्थ घनत्व फिल्टर </td><td> ITOs, Mainz, जर्मनी </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

यह लेख बरकरार माउस रेटिना में fluorescently टैग neuronal आबादी से व्यक्ति की कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग दर्शाया गया है. दो photon अवरक्त उत्तेजना का उपयोग करके transgenetically लेबल कोशिकाओं पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए निशाना बनाया गया उनके प्रकाश प्रतिक्रियाएं, ग्रहणशील फ़ील्ड गुण, और आकृति विज्ञान के अध्ययन.

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Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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