Name: growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00
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Die Arbeit im Labor Duennwald wird durch Zuschüsse aus dem American Federation für Alternsforschung (Afar), der Erbkrankheit Stiftung (HDF) und der William Wood-Stiftung unterstützt.

1. Expression von toxischen PolyQ-Erweiterung Proteine ​​in Hefe Eine systematische Analyse der genauen Aminosäuresequenz eines Proteins Polyglutamindomänen-Erweiterung, die erforderlich ist, um Toxizität in Hefe 7 erzeugen hergestellt wird. Diese toxische Polyglutamindomänen-Expansion-Protein enthält eine Amino-terminalen FLAG-Tag durch 17 Aminosäuren von der ursprünglichen Sequenz des Huntingtin-Protein, einem Polyglutamindomänen Region und eine Carboxy-terminale Fusio...

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	<li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+and+neurodegeneration.">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li><li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment.">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li><li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+repeats+and+neurodegeneration.">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains.">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li><li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease.">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li><li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity.">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li><li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells.">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+and+bread+to+brains+and+beyond:+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease.">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li><li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast.">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li><li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+(-)-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li></ol>

Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzende experimentelle Ansätze zu Polyglutamindomänen-Toxizität in der Modell-Organismus Hefe zu vermindertem Wachstum von Hefe-Zellen, die toxische Polyglutamindomänen-Erweiterung der Basis von Proteinen zu messen. Work in Hefe hat tiefe Einblicke in die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen der Fehlfaltung und dessen entsprechend Toxizität, einschließlich der Fehlfaltung und Toxizität von Polyglutamindomänen-Erweiterung Proteine ​​9,11,12</sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Instruments </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 Pins) </td><td> V &amp; P Scientific, San Diego </td><td> VP 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves USA </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100-Well-Wabenplatten </td><td> Growthcurves USA </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast

Fehlfaltung mit vielen Krankheiten, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und Huntington-Krankheit 1 zugeordnet ist. Huntington-Krankheit (HD) durch die anormalen Entwicklung eines Polyglutamin (Polyglutamindomänen) Bereich innerhalb des Proteins Huntingtin verursacht. Die Polyglutamindomänen-expanded Huntingtin-Protein erreicht eine anomale Konformation (dh es misfolds) und verursacht zelluläre Toxizität 2. Mindestens acht weiteren neurodegenerativen Krankheiten werden durch Polyglutamindomänen-Erweiterungen, einschließlich der Spinozerebelläre Ataxien und Kennedy-Syndrom 3 verursacht. Der Modellorganismus Hefe hat wesentliche Einblicke in die zellulären und molekularen Grundlagen der Polyglutamindomänen-Toxizität erleichtert, einschließlich der Auswirkungen von intra-und inter-molekularen Faktoren der Polyglutamindomänen-Toxizität und die Identifizierung von zellulären Signalwegen, die in Zellen beeinträchtigt sind Ausdruck Polyglutamindomänen-Expansion Proteine ​​8.3. Wichtigly, wurden viele Aspekte der Polyglutamindomänen-Toxizität, die in der Hefe gefunden wurden, in anderen experimentellen Systemen und in gewissem Maße in Proben von HD-Patienten reproduziert und bewiesen damit, die Bedeutung des Hefe-Modell für die Entdeckung der grundlegenden Mechanismen zugrunde Polyglutamindomänen-Toxizität. Eine direkte und relativ einfachen Weg, um Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe zu bestimmen ist, um das Wachstum von Hefe-Defekte Zellen, die Proteine ​​Polyglutamindomänen-Expansion zu messen. Dieses Manuskript beschreibt drei komplementäre experimentelle Ansätze zur Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe durch Messung bestimmen das Wachstum von Hefe-Zellen, die Proteine ​​Polyglutamindomänen-Expansion. Die ersten zwei experimentelle Ansätze verfolgen das Wachstum der Hefe auf Tellern, überwacht der dritte Ansatz, das Wachstum von flüssigen Hefekulturen mit dem BioscreenC Instrument. Darüber hinaus beschreibt diese Handschrift experimentellen Schwierigkeiten, die auftreten beim Umgang mit Hefe Polyglutamindomänen Modelle können und skizziert Strategien, die helfen, oder zu vermeiden wirddiese Schwierigkeiten zu minimieren. Die Protokolle können die hier beschriebenen zu identifizieren und zu genetischen Wegen und kleinen Molekülen, die Polyglutamindomänen-Toxizität modulieren zu charakterisieren. Darüber hinaus können die beschriebenen Assays als Template für eine genaue Analyse der Toxizität von anderen Krankheit assoziierte fehlgefaltete Proteine ​​in Hefe verursacht Modelle dienen.

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Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzenden Protokolle zur Beurteilung der Toxizität von Polyglutamin (Polyglutamindomänen)-Expansion Proteinen in der Hefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Diese Protokolle können einfach modifiziert, um die Toxizität von anderen fehlgefaltete Proteine ​​in Hefe zu überwachen.

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Forschung

Biologie

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Vergleichende Analyse von Human Growth Hormone im Serum Mit SPRi, Nano-SPRi und ELISA-Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...