Name: derivation of glial restricted precursors from e13 mice
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Devin Gary for sin indsigt og feedback på brugen af ​​GRP celler.

Indledning I denne protokol vi vise, hvordan man uddrage, udvælge og plade gliale begrænsede forløber (GRP) celler fra rygmarven af ​​E13 musefostre. Disse celler er tidlige forstadier i de oligodendrocytic og astrocytisk cellelinier og er defineret ved deres ekspression af A2B5. I GRP medium suppleret med FGF-2, vil A2B5 + GRP begynder at udtrykke den tidlige oligodendrocytic linie markører PDGFαR og NG2 1,2. Disse oligodendrocytceller afstamningsceller celler passerer gennem en serie af særskilte fænotypiske faser, som hver af dem er kendetegnet ved morfologiske ændringer, såvel som ekspression af markører til specifikke udviklingsstadier. Disse precursorceller øjeblikket undersøgt som en potentiel kilde for celle-baserede terapeutiske tilgange i sygdomme i centralnervesystemet hvidt stof, herunder dissemineret sklerose, leukodystrophies og periventricular leukomalacia (PVL) 3,4,5,6 </sop&gt;. Undersøgelser under anvendelse af humant hjerne-afledt oligodendrocyt-afstamningsceller precursorer har rapporteret vellykkede remyelinering i hjerne shiverer muse dysmyelination model samt demyeliniserede rygmarv gnavermodeller 6,7,8,9. Disse gliale precursorceller er også blevet anvendt i undersøgelser af andre hvid substans-sygdom modeller såsom rygmarvslæsion og amyotrofisk lateral sklerose 10,11,12,13. Vores laboratorium har udviklet en tidlig postnatal hypoxi-iskæmi musemodel, som vi evaluerer effekten af disse rygmarven afledt GRP celler som en styrkende tilgang i PVL, den førende årsag til cerebral parese 14,15,16. Der er også en gnaverhjerne afledt OPC model, der er almindeligt anvendt til at studere hvidt stof skade, da GRP celler har en tendens til at differentiere ind i astrocytisk pathway 17. OPC fænotype har allerede indtastet oligodendrocyt afstamning vej, et fænomen, der synes irreversible. Men vi er interesseret i at vurdere respons på et bredere spektrum af oligodendrocyt stamfædre, herunder GRP og måske endda NEPS afledt ved E10.5. Af denne grund har vi vedtaget rygmarven afledt GRP model for vores arbejde. Ud over anvendelsen af GRP til celle udskiftning tillader udledning af disse celler fra vild type og transgene gnavermodeller af hvide substans sygdomme yderligere undersøgelse glial differentiering under normale tilstande og sygdomstilstande i en in vitro miljø. Tidligere publikationer viser tegn på selektiv sårbarhed oligodendrocytic afstamning præcursorceller til forskellige eksterne stressfaktorer såsom modning afhænger glutamatexcitotoksicitet, oxidativ stress, og vælg faktorer impliceret i neuroinflammation 18,19. Vores undersøgelser har fokuseret på at forstå de cellulære og molekylære mekanismer bag udviklingen af ​​disse hvide substans skader, vurdere følsomheden af ​​celler iden oligodendrocyt afstamning spektret at fornærme samt analysere formodede terapeutiske tilgange. Materialer Alle procedurer, der involverer dyr i overensstemmelse med PHS politik og JHU IACUC. Alle procedurer bør udføres i et laminært stinkskab for at opretholde aseptiske forhold. Almindeligvis dissektioner udføres i en horisontal strømning hætte og in vitro arbejde i en lodret strømning hætte. Alle medier bruges koldt under dissektioner. Musene anvendt i vores undersøgelse er en vildtype CD-1 stammen og en transgen GFP i en C57/BL6 baggrund. En CD-1 mus dæmning typisk giver 10 + fostre, som er nok til at frø 1-2 T25 kolber. Typisk anvendes to dæmninger aflives på et tidspunkt og føtale rygmarv puljet og udpladet i en T25 kolbe pr dæmningen. Når cellerne er blevet udledt de kan udvides og karakteriseres in vitro til efterfølgende undersøgelser. 1. Udarbejdelse af medier og kolber <ul type="disc"><li> GRP lagermedium anvendes som dissektionsmedium: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x, Invitrogen) n2 (100x; Invitrogen) kosttilskud og bovint serumalbumin (BSA, 0,5% w / v). </li><li> Dissociation medium: Samme som dissektion medium. </li><li> Dyrkningsmedium: GRP lager medium + FGF-2 (10-20 ng / ml Invitrogen) og heparin (1 ug / ml, Sigma). </li><li> PLL / laminin overtrukne 75 cm2 eller 25 cm2 kolber (T75 eller T25). </li><li> Vævskulturkolber (75 cm2, Falcon) blev coatet med 15-20μg/ml Poly-L-lysin (PLL, Sigma) i destilleret H2O, inkuberet ved 37 ° C i 1 time og derefter aspireret. Kolberne blev vasket 1 gang med PBS og derefter coatet med 15-20 ug / ml laminin (Sigma) i PBS ved 37 ° C i 1 time, derefter aspireret, og frisk PBS eller medium tilsættes, indtil cellerne er klar til at blive belagt. Efter coating bør kolber aldrig tilladt at tørre, men kan holdes i PBS eller medium ved 4 ° C i korte perioder før brug. </li></ul> 2. Instrumenter og Other Material <ul type="disc"><li> Petriskåle: 4 per Dam: 3 petriskåle til dissektion (75 mm), en 20 mm skål til opsamling af de høstede rygmarven. </li><li> Store sakse (43 mm Operativsystemer saks, Roboz) og væv pincet for at åbne dæmningen s maven. </li><li> Lille saks for dissekere livmoderen og fjernelse af fostrene (15 mm Micro dissekere Saks, Roboz). </li><li> Micro dissekere foråret sakse (6 mm) til at dissekere rygmarven af ​​fostrene. </li><li> Micro dissekere vinklede Tang til forankring dæmningen og fostervægt under operationen og senere fjerne rygmarven gang udsat. </li><li> 40 eller 70 mikrometer celle si til fjernelse af cellerester før udpladning. </li><li> 0,05% trypsin forvarmet til 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), fremstillet som en 100X stamopløsning (1 g / ml). </li><li> Bio-fare taske til dyrekadavere. </li><li> 15 og 50 ml centrifugerør til forarbejdning udvindes rygmarven. </li></ul> 3. Bestemmelse Tidsindstillet Pregnancy Gravide mus dæmninger er enten bestilles fra kommercielle kilder angiver levering på fosterdag E12 eller E13 på fosterudvikling eller graviditet bestemt in-house. Kort fortalt er to hunner placeres sammen med en mand i den sene eftermiddag og efterladt natten sammen. Den næste dag hunner iagttages for tilstedeværelsen af ​​vaginalt placeret slim prop. Den slim stik er kun en indikation af, at parring fandt sted så dyrene efterfølgende vejes dagligt for at overvåge hastigheden af ​​vægtforøgelse. Dagen slim proppen iagttages er defineret som embryonisk dag (E1). 4. Tissue Udledning <ol><li> Arbejdet skal foregå under et horisontalt flow hætte for at opretholde aseptiske betingelser. </li><li> Spray ned hætte og arbejdsområde med 70% ethanol. </li><li> Autoklave instrumenter eller spray rigeligt med 70% ethanol. </li><li> Forbered instrumenter, medier og mikroskop til brug. </li><li> Hæld 20 ml kold dissektionsmedium i sterilt Petri dish. </li><li> Bedøve dyret med chloralhydrat (500 mg / kg) administreret intraperitonealt (IP) efterfulgt af cervikal dislokation eller halshugning. </li><li> Spray abdominale område af dæmningen med 70-90% ethanol (desinfektion) </li><li> Åbn maven med stor saks og pincet. <ol type="a"><li> I CD1 og C57/BL6 stammer: Normalt 8 til 14 fostre vil være inde i livmoderen. Antallet af fostre er stammeafhængig. </li></ol></li><li> Uddrag musen livmoderen, herunder hvalpene og anbringes i frisk koldt dissektionsmedium i en ren petriskål til at vaske blod og væv snavs fra foster. </li><li> Uddrag hver fosteret fra livmoderhorn og adskille dem fra den embryonale SAC og placenta ved hjælp af en lille saks. Overfør de udtrukne fostrene i frisk dissektionsmedium i en ny petriskål. <ol type="a"><li> Dissektionsmedium være ved lav temperatur til at sænke metabolisk aktivitet og bevare levedygtigheden af ​​afledte celler. </li><li> Arbejdet fra nu af med to pincet ogmikro dissekere forår-saks. </li></ol></li><li> Arbejde under dissektion mikroskop, skære huden langs rygmarven med mikro-kirurgiske sakse og skræl hud tilbage for at afdække rygmarven. </li><li> Tværsnit rygmarven med mikrokirurgiske saksen ved ca C1 og ved begyndelsen af ​​halen. </li><li> Fjerne rygmarv med stumpe pincet, at alle knogler og brusk fjernes og overføres til 3. petriskålen dissekere medium. </li><li> For at forhindre overvækst af meningeal væv i efterfølgende cellekulturer forsøger at fjerne så meget af meninges som muligt fra rygmarven. På grund af de fremspirende udragende perifere nerver er vanskeligere end at fjerne meningeal væv fra ekstraheret cerebrum. </li><li> Når meninges er blevet fjernet, overføre rygmarve til 20 mm petriskål </li><li> Oprensning ved grundigt at sprøjte området med 70-90% ethanol. </li><li> Følgende trin til adskillelse skal gøres hurtigt for at opretholdeen høj levedygtighed afledte rygmarv. </li></ol> 5. Kultur Etablering <ol><li> Trypsin bør forvarmes i mindst 30 minutter i et 37 ° CH2O-bad. En passende alikvot bør fjernes fra bestanden til at reducere eksponeringen af ​​bestanden for temperatursvingninger. </li><li> Overføre de høstede rygmarv til et 50 ml centrifugerør indeholdende 10 ml forvarmet trypsin (0,05%; kvalitet Biologicals) og 100 pi DNAse (10 mg / ml) og tritureres kortvarigt. </li><li> Inkuber i 37 ° CH2O-bad i 10 minutter. </li><li> Udrives og inkuber i yderligere 10 minutter. </li><li> Tilsæt 5 ml GRP medium (defineret ovenfor) og centrifugeres i 5 minutter ved 1000 RPM. </li><li> Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml GRP medium, og der tilsættes DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma). </li><li> Inkuber i 37 ° CH2O-bad i 10 minutter. </li><li> Centrifugeres i 5 minutter ved 1000 opm og aspirere supernatant. </li><li> Resuspender pellet med fresh GRP medium og derefter filter snavs med en 40 til 70 um celle si. </li><li> Plade på PLL / laminin coatede 25 cm2 kolber (T25) og inkuber ved 37 ° C, 95% fugtighed og 5% CO2. </li><li> 100% medier ændre på følgende dag. </li><li> På dette tidspunkt, har GRP monteret og begyndte at udvide processer. </li></ol> 6. Immunopanning GRP Befolkning <ol><li> Pladen rygmarv i PLL / laminin overtrukne kolber indtil kolbe er 85-90% sammenflydende eller omkring en uge. </li><li> Høst celler ved skrabning kolbe med en gummispatel og med 0,05% trypsin, tritureres grundigt, men forsigtigt, centrifugeres ved 1000 rpm i 5 minutter og grundigt resuspender pelleten med 3 ml GRP medium. </li><li> Overfør 1 ml hver til 3 T25 kolber eller 3 ml til en T75 kolbe tilsættes passende rumfang medium til fuldstændigt at dække celler og tillade kolber for at nå 80-90% konfluens. </li><li> Skift medier hver anden dag, tidligere, hvis mediet opbruger hurtigt. </li><li> Coat Bakteriologisk Petri retter (75 mm) natten over ved 4 ° C med et anti-muse-IgM-antistof (Southern Biotech), 10 ug / ml i PBS. </li><li> Aspirer overskydende buffer og vask petriskåle 3x med PBS. </li><li> Tilsættes A2B5-antistoffet (Millipore) ved en koncentration på 5 ug / ml fortyndet i PBS og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (RT). </li><li> Pladerne skylles igen 3x med PBS derefter tilsættes 8 ml GRP medium for at forhindre udtørring af pladen. </li><li> Overfør 5 ml GRP medium fra petriskåle og høst GRP celler ved skrabning kolber med en gummispatel for at frigøre alle celler </li><li> Tritureres cellesuspension kortvarigt at opbryde klumper og overføre 5ml cellesuspension til A2B5 overtrukne bakteriologiske Petriskåle. </li><li> Inkuber 1 time ved stuetemperatur uden omrystning. </li><li> Efter 1 time Aspirer medier og Pladerne skylles 8x med PBS. </li><li> Forsigtigt skrabe celler med en gummi politimand i 2 ml GRP medier og derefter overføre til PLL / laminin plader eller kolber med passende mængde GRP medium. </li&gt; </ol> 7. Frysning og opbevaring af afledte celler <ol><li> Celler høstes fra en 85-90% konfluente T25 eller T75 kolbe med 2 ml 0,05% trypsin. </li><li> Trypsin fortyndes og inaktiveres med 8 ml GRP lager medium og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min. </li><li> Pellets fra T25 kolber resuspenderet i 1 ml GRP frysemedium (GRP lager medium suppleret med 10% (v / v) DMSO og eventuelt 20% FBS). De større pellets fra T75 kolber fortyndes to gange. </li><li> Cellesuspensioner af 1,5 - 3 x 10 10,11,12,13 celler overføres til kryogene hætteglas (Nalgene) og opbevaret natten over i en kryogen beholder (Nalgene) indeholdende isopropanol ved -80 ° C langsomt fryse natten over. </li><li> Efter natten fryse celler overføres til fryser kasser og opbevares 6 måneder til 1 år ved -80 ° C eller længere sigt i N (l). Optøede celler er typisk 60-80% levedygtige stort set afhængigt af kvaliteten af ​​PLL / laminin coating. </li></ol&gt; 8. Repræsentative resultater CO 2 ikke anvendes til bedøvelse af dyret på grund af den mulige nedstrøms effekt på levedygtigheden af fostre og i sidste ende de afledte celler. Endvidere vil det være meget vanskeligt at fuldstændig fjerne meninges fra rygmarv under udledningen procedure, men kombinationen af ​​GRP medium og immunopanning vil eliminere disse hurtigt voksende celler. Tilsvarende er hele rygmarven høstet trods større ventral koncentration af GRP population på grund af sin oprindelse i det ventrale rygmarv og migrerer dorsalt 20. Men GRP mediet vælger for GRP fænotype, og at befolkningen er maksimeres ved A2B5 immunopanning. Efter udpladning rygmarvsvæv, er in vitro-kulturer inkuberet i to passager eller omkring en uge. Efter 2 dage i kultur, kan celler af forskellige morfologier kan observeres i vævskulturkolber angiver heterohomogent befolkningen, men GRP medium selekterer for GRP fænotype. Disse celler er en kombination af A2B5 + GRP, E-NCAM + neuronale begrænsede forstadier (NRP) og Nestinmarkøren + og A2B5-neuroepitelceller og eventuelt fibronektin + meningeal celler. Derudover kan mere modne fænotyper være til stede som udtrykker markører, herunder doublecortin og Tuj1 for neuronal afstamning, GFAP for astrocytter og PDGFaR og GalC for oligo linie for at maksimere en yderst GRP beriget population af udgangsmaterialet heterogene pool (figur 1A), celler kan være dobbeltstrenget immunopanned at udvælge og fjerne de E-NCAM +-celler efterfulgt af selektion for A2B5 + GRP population, når celledensiteten er steget til ca 85-90% konfluens i T75-kolber. Disse GRP celler bevarer deres evne til at blive astrocytter selvom det er i et medium, der selekterer for oligodendrocyt fænotype så efterfølgende A2B5 immunopanning kan være nødvendigt at opretholde et højt beriget GRP population. Immunopanning geneallierede udbytter op til 95% A2B5 +-celler, men endnu større udbytte A2B5 konjugerede magnetiske perler (Miltenyi Biotec Inc.) kan anvendes til at tilvejebringe et udbytte på op til 97%. Årvågenhed i forbindelse med vedligeholdelse GRP kulturer såsom regelmæssige medier ændringer vil minimere spredning af ikke-GRP celletyper. Selv i fravær af BMP-4 astrocytter stadig kan findes, og depleteret medier især synes at inducere differentiering til en astrocytisk fænotype. Selv om B27 supplement indeholder tri-iodthyronin hormon (T3), har der ikke været observeret tendens til at differentiere til oligodendrocytter i GRP populationen, når højere niveauer af T3 tilsættes til mediet betyder dette fænomen forekommer. Imidlertid kan en T3 frit B27 supplement kan være substitueret, hvis der er et problem for kontaminering af modne oligodendrocytter (figur 1B). Disse GRP celler kan let identificeres ved deres morfologi af små soma med 2 eller 3 korte processer, men at screene for andre celletyper, der kan være til stede, immunocytochemistry kan udføres for de tidligere nævnte fælles udviklingsmæssige og celletype-specifikke markører. Der vil sædvanligvis være en lille vedvarende population af A2B5-celler, som er neuroepitel (NEP), og som kan blive enten GRP eller NRP. Heldigvis er de længere cellerne opretholdt i GRP medium mere sandsynligt, at mediet kan vælges til GRP fænotype. <img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> Figur 1. A) belagte rygmarv celler heterogene morfologi observeret efter 2 dage i kultur. B) Immunopanning maksimerer en meget GRP-beriget population fra udgangsmaterialet heterogene pool.

<ol>
	<li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord:+isolation,+characterization,+and+clonal+analysis.">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li><li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells.">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li><li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system.">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li><li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin.">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease.">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li><li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitors+survive,+proliferate,+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination.">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li><li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li><li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse.">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li><li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells.">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li><li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia.">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li><li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain.">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li><li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS.">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li><li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate.">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li><li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+cerebral+palsy:+which+ones+are+best.">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li><li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variability,+injury+distribution,+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain.">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li><li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li><li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+A2B5++glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells.">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li><li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes.">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances.">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li><li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord.">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li><li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity.">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li><li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

Denne undersøgelse blev finansieret af National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), og R01NS028208 (MVJ)] og Child Neurology Foundation. Indholdet af denne rapport er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Health, DHHS. Forfatterne har ingen interessekonflikter er relevante for denne undersøgelse.

<p class="jove_content"&gt; Lidelser i centralnervesystemet hvide substans omfatter et stort antal ætiologier, herunder genetiske, inflammatoriske, iskæmisk og toksiske årsager<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Mens multipel sklerose og vaskulopatier er den førende årsag til hvid substans-sygdom hos voksne, periventricular leukomalacia forbundet med præmatur er den mest almindelige årsag til hvid substans skade i barndommen population. For yderligere at afgrænse sygdomsmekanismer yderligere undersøgelse af celler ofoligodendrocytic slægt, som er stærkt påvirket af den perinatale insult, er påkrævet. GRP blev isoleret fra gnaver embryoniske rygmarven og vist at være tripotential karakter, som giver anledning til oligodendrocytter og to forskellige astrocyt populationer, men ikke differentiere i neuroner<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Ligeledes har oligodendrocytpræcursorceller (OPC) afledt fra rotte synsnerven og sene embryonale eller tidlig postnatal rotte hjerne blevet påvist, at modnes til fungerende oligodendrocytter i de relevante medieforhold<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Derudover har føtal eller voksen afledt menneske OPC blevet yderligere manipuleret ind i mere modne oligodendrocyt fænotyper<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; GRP celler er blevet isoleret fra både rygmarv E13.5 rotter og E12-13,5 hos mus. I de rotter forskelle er blevet rapporteret mellem Dorsal-og ventrale-afledte GRP celler i deres reaktion på vilkår, der fremmer generation af oligodendrocytter, eller astrocytter med ventral-afledte GRP udviser en større tilbøjelighed til at differentiere til de mere modne fænotyper<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Dette kan skyldes den ventrale til dorsale migration af nascente GRP celler, der kan være mindre modtagelige for differentiering signaler. Immunopanning tillader subpopulationen, der udtrykker A2B5 skal isoleres og opsamles til vedligeholdelse i kultur.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vores muse GRP kulturer afledt fra total rygmarv, der giver en heterogen, poolet population af celler, hvorfra GRP celler selekteres ved kemisk (medium), og antistof-baserede teknikker. Mens vore undersøgelser har anvendt rygmarv afledt muse GRP-celler, er det for nylig blevet rapporteret afledning af hjerne-afledt muse oligodendrocytceller progenitorceller, der også er i stand til at udvikle sig til modne oligodendrocytter<sup&gt; 31</sup&gt;. Her afledte cellerne oprindeligt dyrket som oligospheres, at anvendelse af den passende dyrkningsmediet er manipuleret ind i en beriget PDGFαR +, OPC befolkning<sup&gt; 31</sup&gt;. Vore undersøgelser har fokuseret på virkningen af ​​vores model af hypoxisk-iskæmisk insult på celler i oligodendrocyt linie spektret fra A2B5 + og PDGFαR-GRP prækursorer til myelin basisk protein ekspression (MBP +) modne oligodendrocytter. Faktisk vores<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering har vist, at disse umodne GRP celler modne i MBP udtrykkende celler, enten i monokulturer eller i co-kulturer med kortikale neuroner. Disse celler kan manipuleres i kultur i specifikke differentiering veje for at studere de mekanismer, der er involveret i perinatal hvid substans skade. Der er flere musemodeller af hvide substans sygdomme, som involverer celler af oligodendrocyt afstamning og tilgængeligheden af ​​denne befolkning giver mulighed for en grundig undersøgelse af de mekanismer, der forårsager skade samt at undersøge nytten af ​​mulige celleterapi valgmuligheder.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Navn på reagenset </th><th> Firma </th><th> Katalog nummer </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> RH-FGF-basisk </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Trypsin (0,05%) EDTA </td><td> Kvalitet Biologisk, Inc. </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysin HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma </td><td> L2020-1mg </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

Dette er en protokol til afledning af gliale begrænsede prækursorer (GRP) celler fra rygmarven af ​​E13 musefostre. Disse celler er tidlige forstadier i oligodendrocytic cellelinie. For nylig er disse celler blevet undersøgt som potentiel kilde til genoprettende behandlinger i hvide substans sygdomme. Periventricular leukomalacia (PVL) er den førende årsag til ikke-genetiske hvid substans-sygdom i barndommen og påvirker op til 50% af ekstremt tidligt fødte spædbørn. De data, der tyder på en øget følsomhed over for at udvikle hjernen til hypoxi-iskæmi, oxidativ stress og excitotoxicity der selektivt er rettet mod spirende hvide substans. Gliale begrænsede prækursorer (GRP), oligodendrocyt stamceller (OPC) og umodne oligodendrocytter (preOL) synes at være centrale aktører i udviklingen af ​​PVL, og er genstand for fortsatte undersøgelser. Endvidere har tidligere undersøgelser identificerede en delmængde af CNS-væv, der har øget modtagelighed for glutamat-excitotoksicitet, somsamt en udviklingsmæssig mønster denne modtagelighed. Vores laboratorium undersøger i øjeblikket rolle oligodendrocyt stamfædre i PVL og brug celler på GRP udviklingstrin. Vi benytter disse afledte GRP celler i flere eksperimentelle paradigmer til at teste deres svar at vælge spændinger i overensstemmelse med PVL. GRP celler kan manipuleres in vitro i OPCs og preOL til transplantationsformål eksperimenter med muse pVL modeller og in vitro modeller for PVL-lignende fornærmelser herunder hypoxi-iskæmi. Ved anvendelse af dyrkede celler og in vitro-undersøgelser der ville blive reduceret variation mellem eksperimenter, hvilket letter fortolkning af dataene. Dyrkede celler giver også mulighed for berigelse af GRP befolkningen og samtidig minimere virkningen af ​​kontaminerende celler af ikke-GRP fænotype.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice at JoVE.com

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Denne protokol beskrives udledning af glial begrænsede prækursorer fra føtale rygmarv og holdes in vitro enten transplantation eller til undersøgelse af oligodendrocytic afstamning.

Udledning af Glia begrænsede prækursorer fra E13 mus

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering og dyrkning af hippocampus neuroner fra Prænatal Mus

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af neurale Crest stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Udledning af leptomeninges eksplantatkulturer fra Postmortem menneskehjerne donorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Differentiering af musen embryonale stamceller i kortikale Interneuron prækursorer

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Kanyle implantering i Cisterna Magna af gnavere

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Indspilning rumligt begrænset svingninger i Hippocampus adfærd mus

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...