Name: derivation of glial restricted precursors from e13 mice
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice at JoVE.com

We willen Dr Devin Gary bedanken voor zijn inzicht en feedback over het gebruik van GRP cellen.

Introductie In dit protocol laten we zien hoe te winnen, te selecteren en de plaat gliale beperkte precursor (GRP) cellen van het ruggenmerg van de E13 muis foetussen. Deze cellen zijn vroege voorlopers binnen de oligodendrocytic en astrocytaire cellijnen en wordt bepaald door hun uitdrukking van A2B5. In het GRP medium aangevuld met FGF-2, zal de A2B5 + GRP&#39;s beginnen de uiting van de vroege oligodendrocytic lijn markers PDGFαR en NG2 1,2. Deze oligodendroglia lijn cellen langs een reeks afzonderlijke fenotypische fasen, elk gekenmerkt door morfologie, en expressie van markers specifieke ontwikkelingsstadia. Deze voorloper cellen worden momenteel bestudeerd als een potentiële bron voor cel-gebaseerde therapeutische benaderingen in aandoeningen van het centrale zenuwstelsel witte stof, met inbegrip van multiple sclerose, leukodystrophies en periventriculaire leukomalacie (PVL) 3,4,5,6 </sup&gt;. Studies met menselijke hersenen afgeleide oligodendrocyt lijn voorlopers hebben gemeld succesvol remyelinisatie in hersenen van de muis shiverer dysmyelination model als in gedemyeliniseerde ruggenmerg knaagdiermodellen 6,7,8,9. Deze gliale voorloper cellen zijn ook gebruikt in studies van andere wittestofziekte modellen zoals ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose 10,11,12,13. Ons laboratorium heeft een vroege postnatale hypoxie-ischemie muismodel waarmee we het evalueren van de werkzaamheid van deze ruggenmerg afgeleid GRP cellen als een restauratieve aanpak in PVL, de belangrijkste oorzaak van hersenverlamming 14,15,16. Er is ook een knaagdier hersenen afgeleide OPC model dat op grote schaal gebruikt voor het bestuderen witte stof schade omdat de polyester cellen neiging om te differentiëren in de astrocytic route 17. De OPC-fenotype is al ging de oligodendrocyt lijn weg, een fenomeen dat lijkt irreversible. We zijn echter geïnteresseerd zijn in de beoordeling van de respons van een breder spectrum van oligodendrocyt voorlopercellen ook GRP&#39;s en misschien zelfs de NEP&#39;s afgeleid op E10.5. Om deze reden hebben we aangenomen het ruggenmerg afgeleid GRP-model voor ons werk. Naast het gebruik van GRP voor celvervanging de afleiding van deze cellen van wildtype en transgene diermodellen van ziekte kan witte stof nader onderzoek naar gliacellen differentiatie onder normale en aandoeningen in een in vitro omgeving. Vorige publicaties aantonen van selectieve kwetsbaarheid van oligodendrocytic lijn voorloper cellen aan verschillende externe stressoren, zoals rijping afhankelijk van glutamaat excitotoxiciteit, oxidatieve stress, en selecteer factoren betrokken in ontstekingsprocessen 18,19. Onze studies hebben zich gericht op het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen achter de ontwikkeling van deze witte stof letsels, het evalueren van de gevoeligheid van cellen inde oligodendrocyt afstamming spectrum zo goed beledigen als het analyseren van vermeende therapeutische benaderingen. Materialen Alle procedures met betrekking tot dieren voldoen aan PHS beleid en de JHU IACUC. Alle procedures worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap om aseptische omstandigheden. Gewoonlijk secties worden uitgevoerd in een horizontale stroming kap en in vitro onderzoek in een verticale kap. Alle media dat koud wordt gebruikt tijdens de dissecties. De muizen die in deze studie zijn wildtype CD-1-stam en transgene GFP in een C57/BL6 achtergrond. Een CD-1 muis dam levert meestal 10 + foetussen die voldoende zijn om zaad 1-2 T25 flessen. Meestal worden twee dammen opgeofferd op een moment en foetale ruggenmerg samengevoegd en uitgeplaat in een T25 fles per dam. Wanneer cellen afgeleid kunnen worden uitgebreid en kenmerk vitro voor verdere studies. 1. Voorbereiding van de media en Kolven <ul type="disc"><li> GRP voorraadmedium wordt gebruikt als Dissection medium: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x, Invitrogen) N2 (100x, Invitrogen) en aanvullingen Bovine Serum Albumine (BSA, 0,5% w / v). </li><li> Dissociatie medium: hetzelfde als dissectie medium. </li><li> Cultuur medium: GRP voorraad medium + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) en heparine (1 pg / ml, Sigma). </li><li> PLL / laminine gecoat 75 cm 2 of 25 cm 2 flessen (T75 of T25). </li><li> Weefselkweekflessen (75 cm2, Falcon) werden gecoat met 15-20μg/ml Poly-L-lysine (PLL, Sigma) in gedestilleerd H2O, geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur dan afgezogen. Flessen worden gewassen met PBS 1X vervolgens bekleed met 15-20 pg / ml laminine (Sigma) in PBS bij 37 ° C gedurende 1 uur, vervolgens afgezogen en verse PBS of media toegevoegd totdat cellen bereid worden uitgeplaat. Na coating moet kolven nooit drogen, maar kan worden gehouden in PBS of media bij 4 ° C voor korte perioden voor gebruik. </li></ul> 2. Instrumenten en Other Materiaal <ul type="disc"><li> Petrischalen: 4 per dam: 3 petrischalen voor dissectie (75 mm), een 20 mm schaal voor het verzamelen van de geoogste ruggenmerg. </li><li> Grote schaar (43 mm Operating schaar, Roboz) en weefsel tang voor het openen van de dam s buik. </li><li> Kleine schaar voor het ontleden van de baarmoeder en het verwijderen van de foetussen (15 mm Micro ontleden van Schaar, Roboz). </li><li> Micro ontleden van de lente schaar (6 mm) aan het ruggenmerg van de foetussen te ontleden. </li><li> Micro ontleden gebogen tang voor het verankeren van de dam en foetale lichaam tijdens de operatie en later verwijderen van het ruggenmerg een keer blootgesteld. </li><li> 40 of 70 micrometer cel zeef voor het verwijderen van celresten voor plating. </li><li> 0,05% Trypsine voorverwarmd tot 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml DNase 1 (Sigma), bereid zoals 100x voorraad (1 g / ml). </li><li> Bio-hazard tas voor dode dieren. </li><li> 15 en 50 ml centrifugebuizen voor de verwerking van gewonnen ruggenmerg. </li></ul> 3. Het bepalen van Timed Pregnancy Zwangere muis dammen zijn ofwel besteld uit commerciële bronnen met vermelding van levering op embryonale dag E12 of E13 van de ontwikkeling van de foetus of de zwangerschap bepaald in huis. In het kort worden twee vrouwtjes geplaatst samen met een man in de late namiddag en liet &#39;s nachts samen. De volgende dag vrouwtjes waargenomen in aanwezigheid van vaginaal gelegen slijmprop. De slijmprop is slechts een indicatie dat de paring zich zo dieren vervolgens worden gewogen dagelijks aan snelheid van gewichtstoename te controleren. De dag dat de slijmprop wordt waargenomen wordt gedefinieerd als embryonale dag een (E1). 4. Tissue Afleiding <ol><li> Werken onder een horizontale stroming kap om aseptische omstandigheden te behouden. </li><li> Spuit het kap-en werkgebied met 70% ethanol. </li><li> Autoclaaf instrumenten of spray royaal met 70% ethanol. </li><li> Bereid instrumenten, media, en microscoop voor gebruik. </li><li> Breng 20 ml koud dissectie medium in steriele Petri dish. </li><li> Verdoven dier met chloorhydraat (500 mg / kg) intraperitoneaal toegediend (IP), gevolgd door cervicale dislocatie en onthoofd. </li><li> Spuit de buikstreek van de dam met 70-90% ethanol (desinfectie) </li><li> Open buik met grote schaar en tang. <ol type="a"><li> In CD1 en C57/BL6 stammen: Meestal 8 tot 14 foetussen zal zijn in de baarmoeder. Het aantal foetussen is stam afhankelijk. </li></ol></li><li> Pak de muis baarmoeder met inbegrip van de pups en doe dit in vers, koud dissectie medium in een schone petrischaal met bloed en weefsel puin te wassen van de foetus. </li><li> Uittreksel elke foetus uit de baarmoeder hoorn en scheiden ze van de embryonale zak en de placenta met de kleine schaar. Breng de gewonnen foetussen in verse dissectie medium in een nieuw petrischaal. <ol type="a"><li> Dissection medium moet bij lage temperatuur van de metabole activiteit te verlagen en het behoud van leefbaarheid van afgeleide cellen. </li><li> Werk van nu af aan met twee tangen enmicro ontleden van de lente-schaar. </li></ol></li><li> Werken onder dissectie microscoop, knip de huid langs het ruggenmerg met de micro-chirurgische schaar en pel de huid terug naar het ruggenmerg bloot te leggen. </li><li> Doorsnijden het ruggenmerg de microchirurgische schaar ongeveer C1 en het begin van de staart. </li><li> Verwijder het ruggenmerg met stompe tang, moeten alle bot en kraakbeen worden verwijderd en over te brengen naar 3 e petrischaal van ontleden medium. </li><li> Om overmatige groei van meningeale weefsel in de daaropvolgende celculturen te voorkomen proberen om zoveel mogelijk van de hersenvliezen als mogelijk te verwijderen van het ruggenmerg. Als gevolg van de opkomende uitstekende perifere zenuwen is dit moeilijker dan het verwijderen van meningeale weefsel uit gehaald hersenen. </li><li> Zodra hersenvliezen zijn verwijderd, over te dragen ruggenmerg tot 20 mm petrischaal </li><li> Opruimen door grondig spuiten met 70-90% ethanol. </li><li> De volgende stappen voor dissociatie snel worden uitgevoerd handhavenhoge levensvatbaarheid van de afgeleide ruggenmergweefsel. </li></ol> 5. Cultuur Oprichting <ol><li> Trypsine worden voorverwarmd ten minste 30 minuten in een 37 ° CH2 O-bad. Een passende hoeveelheid moet worden verwijderd uit de bouillon aan de blootstelling van voorraad om temperatuurschommelingen te verminderen. </li><li> Breng de geoogste ruggenmerg een 50 ml centrifugebuis met 10 ml voorverwarmde trypsine (0,05% kwaliteit Biologicals) en 100 ul DNAse (10 mg / ml) en vermalen kort. </li><li> Incubeer in 37 ° CH 2 O-bad gedurende 10 minuten. </li><li> Vermaal en incubeer gedurende nog eens 10 minuten. </li><li> 5 ml GRP medium (hierboven beschreven) en gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 1000 rpm. </li><li> Zuig supernatant en pellet hersuspenderen met 10 ml medium polyester en voeg DNAse-1 (10 mg / ml; Sigma). </li><li> Incubeer in 37 ° CH 2 O-bad gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer 5 min bij 1000 rpm en zuig supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen met een frequentiesh GRP medium dan filter vuil met een 40 - 70 pm cel zeef. </li><li> Plaat PLL / laminine bekleed 25 cm2 flessen (T25) en incuberen bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. </li><li> 100% media te wijzigen op de volgende dag. </li><li> Op dit moment hebben GRP&#39;s bevestigd en begon uitbreiding van processen. </li></ol> 6. Immunopanning de GRP Bevolking <ol><li> Plaat ruggenmerg weefsel in PLL / laminine gecoat kolven totdat fles is 85-90% samenvloeiing of ongeveer een week. </li><li> Oogst cellen schrapen kolf met een rubberen spatel of 0,05% trypsine, grondig vermalen maar voorzichtig gecentrifugeerd op 1000 rpm gedurende 5 minuten en grondig Resuspendeer met 3 ml GRP medium. </li><li> Breng 1 ml per m 3 T25 flessen of 3 ml tot 1 T75 fles toe te voegen voldoende hoeveelheden van medium volledig te bedekken cellen en flacons tot 80-90% confluentie bereiken mogelijk te maken. </li><li> Wijzig de media om de andere dag, eerder als medium put snel. </li><li> Coat Bacteriologische Petri schotels (75 mm) gedurende een nacht bij 4 ° C met een anti-muis IgM antilichaam (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. </li><li> Zuig de overtollige buffer en was de petrischalen 3x met PBS. </li><li> Voeg A2B5 antilichaam (Millipore) bij een concentratie van 5 pg / ml verdund in PBS en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Was de plaatjes weer 3x met PBS en voeg dan 8 ml GRP medium om uitdroging te voorkomen van de plaat. </li><li> 5 ml van polyester medium uit Petrischalen oogst GRP cellen schrapen flessen met een rubberen spatel alle cellen los </li><li> Kort Vermaal celsuspensie te breken klonten en 5 ml celsuspensie over te dragen aan de A2B5 gecoate bacteriologische petrischalen. </li><li> Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur zonder schudden. </li><li> Na 1 uur aspiraat media en wassen platen 8x met PBS. </li><li> Voorzichtig schrapen cellen met een rubberen spatel in 2 ml GRP media dan naar PLL / laminine gecoate platen of flesjes over te dragen met de juiste volume van GRP medium. </li&gt; </ol> 7. Invriezen en opslag van afgeleide cellen <ol><li> Cellen worden geoogst van een 85-90% samenvloeiing T25 of T75 kolf met 2 ml 0,05% trypsine. </li><li> Trypsine verdund en onwerkzaam 8 ml polyester stock medium en gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Pellets van T25 flessen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml medium polyester invriezen (GRP stock medium aangevuld met 10% (v / v) DMSO en eventueel, 20% FBS). De grotere pellets van T75 kolven worden verdund tweeledig. </li><li> Celsuspensies van 1,5 - 3 x 10 10,11,12,13 cellen overgebracht naar cryogene flacons (Nalgene) en nacht in een cryogene container (Nalgene) met isopropanol bij -80 ° C langzaam invriezen nacht. </li><li> Na overnacht invriezen cellen overgebracht naar vriezer dozen bewaard 6 maanden 1 jaar bij -80 ° C of langere tijd in N (l). Ontdooide cellen typisch 60-80% haalbaar grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de PLL / laminine coating. </li></ol&gt; 8. Representatieve resultaten CO 2 niet wordt gebruikt verlamming het dier wegens de mogelijke invloed waren op de levensvatbaarheid van de foetussen en uiteindelijk de afgeleide cellen. Bovendien zal het erg moeilijk zijn om volledig de meningen van het ruggenmerg te verwijderen tijdens de afleiding procedure, maar de combinatie van GRP medium en immunopanning een einde zal maken van deze snel groeiende cellen. Evenzo wordt de gehele ruggenmerg geoogst ondanks een hogere concentratie van de ventrale GRP populatie als gevolg van de uit de ventrale ruggenmerg migreren dorsaal 20. Echter, de GRP medium kiest voor de GRP fenotype en dat de bevolking wordt gemaximaliseerd door A2B5 immunopanning. Na plateren ruggenmergweefsel, worden de in vitro kweken geïncubeerd twee passages of een week. Na 2 dagen kweken kan cellen van verschillende morfologie worden waargenomen in de weefselkweekflessen waarin de heterodoorgaand identieke optiek de bevolking, maar de GRP medium kiest voor de GRP fenotype. Deze cellen zijn een combinatie van A2B5 + GRP, E-NCAM + neuronale beperkte precursoren (NHP) en Nestin +, A2B5-neuro-epitheliale cellen en mogelijk fibronectine + meningeale cellen. Daarnaast is meer volwassen fenotypen aanwezig kunnen zijn uitdrukken markers waaronder doublecortin en Tuj1 voor neuronale afkomst, GFAP voor astrocyten en PDGFaR en GalC voor oligo lijn Met het oog op een zeer GRP verrijkt bevolking te maximaliseren van de start heterogene pool (Figuur 1A), kunnen cellen zijn dubbel immunopanned te selecteren en te verwijderen van de E-NCAM + cellen, gevolgd door de selectie voor de A2B5 + GRP bevolking een keer celdichtheid is toegenomen tot ongeveer 85-90% confluentie in T75 flessen. Deze polyester cellen behouden hun vermogen om astrocyten worden ondanks dat in een medium dat selecteert de oligodendrocyte fenotype zodat na A2B5 immunopanning nodig zijn om een ​​hoog verrijkt polyester populatie te houden. Immunopanning algebondgenoot rendementen tot 95% A2B5 + cellen, maar voor een nog grotere opbrengst A2B5 geconjugeerde magnetische korrels (Miltenyi Biotec Inc) kan gebruikt worden om een ​​maximaal rendement van 97% voorzien worden. Waakzaamheid in het onderhoud GRP culturen zoals reguliere media veranderingen zullen het minimaliseren van de verspreiding van niet-GRP celtypen. Ook bij afwezigheid van BMP-4 astrocyten kunnen nog gevonden en uitgeput media in het bijzonder blijkt induceren een astrocytic fenotype. Hoewel B27 supplement bevat tri-jodothyronine hormoon (T3), is er geen waargenomen neiging om te differentiëren tot oligodendrocyten in de polyester populatie, alleen wanneer hogere T3 worden toegevoegd aan het medium betekent dit verschijnsel optreedt. Echter, een T3 gratis B27 supplement worden vervangen als er een punt van zorg voor de besmetting met volwassen oligodendrocyten (Figuur 1B). Deze GRP cellen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door hun morfologie van kleine soma met 2 of 3 korte processen, maar om te screenen op andere celtypen die aanwezig kunnen zijn, immunocytochemistry kan worden uitgevoerd voor de eerder genoemde gemeenschappelijke ontwikkelings-en celtype specifieke markers. Er zal vaak een kleine duurzame populatie van A2B5-cellen die neuroepitheliale (NEP), die geschikt worden ofwel GRP of NHP. Gelukkig zijn de langere cellen gehandhaafd in de GRP medium hoe groter de kans dat medium kiest voor de GRP fenotype. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> Figuur 1. A) vernikkeld ruggenmergcellen heterogene morfologie worden waargenomen na 2 dagen kweek. B) Immunopanning zeer GRP verrijkte populatie maximale vanaf de start heterogene pool.

<ol>
	<li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord:+isolation,+characterization,+and+clonal+analysis.">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li><li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells.">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li><li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system.">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li><li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin.">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease.">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li><li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitors+survive,+proliferate,+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination.">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li><li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li><li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse.">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li><li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells.">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li><li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia.">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li><li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain.">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li><li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS.">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li><li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate.">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li><li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+cerebral+palsy:+which+ones+are+best.">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li><li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variability,+injury+distribution,+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain.">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li><li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li><li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+A2B5++glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells.">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li><li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes.">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances.">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li><li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord.">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li><li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity.">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li><li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

Deze studie werd gefinancierd door het National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), en R01NS028208 (MVJ)] en de Kinderneurologie Foundation. De inhoud van dit rapport zijn uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Institute of Health, DHHS. De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen die relevant zijn voor deze studie.

<p class="jove_content"&gt; Aandoeningen van het centrale zenuwstelsel witte stof omvatten een groot aantal van de etiologie, waaronder genetische, opruiend, ischemische en toxische oorzaken<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Terwijl multiple sclerose en vasculopathies zijn de belangrijkste oorzaak van de witte stof ziekte bij volwassenen, periventriculaire leukomalacie geassocieerd met prematuriteit is de meest voorkomende oorzaak van witte stof schade in de kindertijd bevolking. Om verder af te bakenen ziektemechanismen verdere studie van cellen ofoligodendrocytic afkomst, die sterk worden beïnvloed door de perinatale belediging, is vereist. GRP&#39;s werden geïsoleerd uit het knaagdier embryonale ruggenmerg en aangetoond dat ze tripotential in de natuur, die aanleiding geven tot oligodendrocyten en astrocyten twee verschillende populaties, maar niet differentiëren tot neuronen<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Ook hebben oligodendrocyt precursor cellen (OPC), afkomstig van ratten optische zenuw en de late embryonale of vroege postnatale hersenen van de rat is aangetoond dat in het functionerend oligodendrocyten rijpen in de juiste media voorwaarden<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Daarnaast hebben foetaal of volwassen humaan OPC is verder gemanipuleerd in meer volwassen oligodendrocyt fenotypes<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; GRP cellen zijn geïsoleerd van zowel het ruggenmerg van E13.5 ratten en E12-13.5 bij muizen. Bij de rat verschillen werden gemeld tussen rug-en buik-afgeleide GRP cellen in hun reactie op de voorwaarden die generatie van oligodendrocyten, astrocyten of te bevorderen, met ventrale afgeleide GRP&#39;s vertonen een grotere neiging om te differentiëren in de meer volwassen fenotypes<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Dit kan te wijten zijn aan de dorsale ventraal migratie van de ontluikende GRP cellen, waardoor minder gevoelig voor de differentiatie signalen. Immunopanning zorgt voor de subpopulatie die A2B5 tot uitdrukking te worden geïsoleerd en verzameld voor het onderhoud in de cultuur.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Onze muis GRP culturen worden afgeleid uit de totale ruggenmerg weefsel dat een heterogene, gepoolde populatie van cellen waaruit GRP cellen worden geselecteerd door chemische (medium) en antilichamen gebaseerde technieken oplevert. Terwijl onze studies hebben gebruik gemaakt van de ruggenmerg afgeleid muis GRP-cellen, is het meer recent is gemeld aan de afleiding van hersenen afgeleide muis oligodendrocyt stamcellen die ook in staat zijn om uit te groeien tot volwassen oligodendrocyten<sup&gt; 31</sup&gt;. Hier worden de afgeleide cellen worden in eerste instantie gekweekt als oligospheres dat het gebruik van de juiste kweekmedium worden gemanipuleerd in een verrijkte PDGFαR +, OPC bevolking<sup&gt; 31</sup&gt;. Onze studies hebben zich gericht op het effect van ons model van hypoxische-ischemische belediging op cellen in de oligodendrocyt lijn spectrum van A2B5 +, PDGFαR-GRP voorlopers van de myeline basis eiwit te drukken (MBP +) volwassen oligodendrocyten. Inderdaad onze<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering heeft aangetoond dat deze onvolwassen GRP uitrijping in MBP tot expressie brengen, hetzij in monoculturen of in co-culturen met corticale neuronen. Deze cellen kunnen worden gemanipuleerd in cultuur in specifieke differentiatie signaalwegen voor het bestuderen van de mechanismen die betrokken zijn bij perinatale witte stof letsel. Er zijn verschillende muismodellen van witte stof ziekten waarbij cellen van oligodendrocyt afstamming en de beschikbaarheid van deze populatie zorgt voor diepgaand onderzoek naar de mechanismen die zowel de schade als het nut van de mogelijke celtherapie opties te verkennen veroorzaken.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-basic </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Trypsine (0,05%) EDTA </td><td> Kwaliteit Biologische, Inc </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Sigma </td><td> L2020-1 mg </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

Dit is een protocol voor de afleiding van gliale beperkte precursor (GRP) cellen van het ruggenmerg van de E13 muis foetussen. Deze cellen zijn vroege voorlopers binnen de oligodendrocytic cellijn. Onlangs zijn deze cellen onderzocht als mogelijke bron voor het herstelrecht therapieën in de witte stof ziekten. Periventriculaire leukomalacie (PVL) is de belangrijkste oorzaak van niet-genetische wittestofziekte in de kindertijd en treft tot 50% van extreem premature baby&#39;s. De gegevens wijzen op een verhoogde gevoeligheid van de zich ontwikkelende hersenen aan hypoxie-ischemie, oxidatieve stress en excitotoxiciteit dat zich selectief richt op ontluikende witte stof. Gliale beperkte precursoren (GRP), oligodendrocyt progenitorcellen (OPC) en onvolwassen oligodendrocyten (preOL) lijken de belangrijkste spelers in de ontwikkeling van PVL en zijn het onderwerp van verder onderzoek. Bovendien hebben eerdere studies geïdentificeerd een subset van CZS weefsel dat is toegenomen gevoeligheid voor excitotoxiciteit glutamaat alsen een ontwikkelingspatroon van deze gevoeligheid. Ons laboratorium onderzoekt momenteel de rol van de oligodendrocyt voorlopercellen in PVL en gebruik cellen in het GRP stadium van ontwikkeling. Wij maken gebruik van deze afgeleid GRP cellen in verschillende experimentele paradigma&#39;s om hun reactie op de spanningen in overeenstemming met PVL te selecteren testen. GRP-cellen kunnen worden gemanipuleerd in vitro in OPC&#39;s en preOL voor transplantatie-experimenten met de muis PVL modellen en in vitro modellen van het PVL-achtige beledigingen waaronder hypoxie-ischemie. Door gekweekte cellen en in vitro studies zou worden verminderd variabiliteit experimenten interpretatie van de gegevens vergemakkelijkt. Gekweekte cellen kan ook verrijking van de polyester populatie met een minimaal effect van contaminerende cellen van niet-polyester fenotype.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice at JoVE.com

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Afleiding van leptomeningen Explantatie culturen van postmortaal Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Canule implantatie in de Cisterna Magna van knaagdieren

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Opname ruimtelijk beperkte schommelingen in de Hippocampus gedragen muizen

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...