Name: detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence at JoVE.com

نشكر الدكتور Maiken مايكين (جامعة روتشستر المركز الطبي) لتصميم الرأس لوحة. وقد تم دعم العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة الجوائز إلى SD (R01DA026325 وP30AI078498 والمنح الأساس لKK (دانا أساس الدماغ وبرنامج Immunoimaging، جمعية القلب الأميركية 0635595T ورابطة ALS [# 1112)]).

1. إعداد الحيوان للتصوير ملاحظة: نحن نستخدم الفئران C57BL الكبار. ويمكن استخدام السلالات المعدلة وراثيا مختلفة اعتمادا على سؤال البحث. ومما يسهل عملية جراحية الاوعية الدموية الدقيقة وoximetry نبض في الفئران مع فرو أبيض (على سبيل المثال FVB سلالة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير موقع الجراحة على مقاعد البدلاء. جميع الأدوات الجراحية تحتاج إلى تعقم أو تطهيرها مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود تحقيق المستقيم، وقياس درجة الحرارة بشكل مستمر الحيوان في جميع أنحاء الجسم الإجراء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس في البداية باستخدام 5٪ isoflurane. في 15-30 ثانية، عندما الحيوان لا يتحرك، وضعه على لوحة التدفئة (37 درجة مئوية)، وتطبيق قناع الوجه لتقديم مستمر من الهواء تحتوي على 1،3-1،5٪ isoflurane). تأكد من أن هذا الحيوان لا يستجيب لحافز الألم (على سبيل المثال قرصة الذيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هلام المسيل للدموع اصطناعية لتغطية عيون الماوس،، لمنع التعرض للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحلاقة الكهربائية، وإزالة الشعر وROM الرأس وكلا من الفخذين. تطبق مزيل الشعر (على سبيل المثال نير) في الفخذ لمدة 2 دقيقة، والقضاء بعد ذلك بعناية لإزالة ما تبقى من شعر. وسيتم استخدام هذا الفخذ لoximetry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير فروة الرأس باستخدام 10٪ محلول البوفيدون اليودي والايثانول 70٪. </li></ol> 2. إعداد نافذة مفتوحة الجمجمة الجمجمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انطلاق 5 مم الذيلية في الجمجمة، وجعل شق في فروة الرأس مع مقص، ودفع سنتيمتر واحد. نقل الجلد إلى الجانبين لفضح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة الأغشية على الجزء العلوي من الجمجمة تطبق 10٪ محلول كلوريد الحديديك إلى الجزء العلوي من الجمجمة. يمسح الحل الزائدة، وتتخلص من الأغشية بعيدا مع 45 درجة ملاقط # 5 زاوية. من المهم أن إعداد الموقع بعناية، من أجل ضمان أنه لا يمكن لوحة الرأس بإحكام الجمجمة (خطوات # 4-6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح، وتحديد مجال الاهتمام. لاحظ أنه ينبغي تجنب الغرز في الجمجمة لأن الجمجمة ج1 كسر لا يمكن التكهن به على طول هذه الخطوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طبقة رقيقة من الغراء السريع (على سبيل المثال Locktite 454) حول حواف نافذة لوحة رئيس (الشكل 1). وضع لوحة الرأس في مثل هذه الطريقة التي تتعرض لها المنطقة من اهتمام في الإطار. الضغط الخفيف على لوحة الرأس. تنطبق على كمية صغيرة من الاسمنت الأسنان لتتبلمر الغراء بسرعة. عقد لمدة 10 ثانية في حين أن الصمغ هو البلمره. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنطبق على كمية صغيرة من الغراء السريع إلى حواف النافذة لاغلاق لوحة الرأس والجمجمة. برغي لوحة رئيس لصاحب الحيوان في نطاق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحفر الثاني Microtorque وضعت في 6000 دورة في الدقيقة، وقليلا IRF حفر 005، وإزالة جميع الغراء اضافية من الجمجمة والرأس من لوحة. وينبغي إزالة أي الغراء المتبقية على لوحة الرأس، لأنه سوف يتدخل بطريقة أخرى مع المرفق من الغطاء الزجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الحفر في 1000 دورة في الدقيقة، والبدء في عمليات الحفر في الجمجمة عن طريق دائرة داخل الرأس نافذة لوحة، وقطره 5 أمتار ~م. استخدام حركات كاسحة ضوء كما لو كنت ترسم بالقلم الرصاص لينة جدا. وقف حفر كل ثانية 20-30 لإزالة الغبار العظام باستخدام الهواء المضغوط. ملاحظة: شكل فتحة في الرأس لوحة يسمح بالوصول إضافية لقمة الحفر (على الجراح من اليسار واليمين، وسلم)، والذي يجعل من السهل إنشاء إطار دائري في الجمجمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن اثنين من الثقوب على شكل غريب توفير المساحة المطلوبة لإدراج كلارك، أو قطب كهربائي زجاج كهربائي، في أنسجة المخ تحت النافذة في الجمجمة لقياسات إضافية البولاروجرافي أو الكهربية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تقدم الحفر، يتم تشكيل تحفر حول الجمجمة سليمة في المركز. يجب الحرص على عدم لكزة من خلال الجمجمة ضعيفة، ولكن لجعل هذا الجحر حتى سمك. كن حذرا اضافية حول الأوعية الدموية الكبيرة، لا ينبغي أن يتعرض للخطر، وإذا أمكن، حتى لا تمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام واحد &quot;الساق&quot; من ملاقط رقم 3 لرفع (&quot;نفض الغبار قبالة&quot;) العظم في وسط النافذة. تطبيق قطرة من artificالاتحاد العالمي للتعليم السائل النخاعي (aCSF) على النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح aCSF باستخدام بلطف زاوية ورقة الأنسجة الرخوة (مثل Kimwipe). وعادة ما تلف دورا في واحدة أو أكثر من المناصب حول حافة النافذة. ابتداء من الساعة واحدة من هذه المواقع، ورفع بلطف ثم إزالة الجافية من سطح الدماغ، وذلك باستخدام 45 درجة زاوية ملاقط # 5. عند اختيار موقع في أي لبدء إزالة الجافية، وتجنب المناطق المتاخمة للالأوعية الدموية الكبيرة. إذا كان النزيف يحدث، وتطبيق قطرة من aCSF والانتظار لمدة 2-3 دقائق لوقف نزيف قاصر على التوقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.07٪ منخفضة ذوبان الاغاروز حل في aCSF) إحضار الاغاروز ذاب لدرجة حرارة الجسم. يمحو الفائض من aCSF من سطح الدماغ. صب الاغاروز في النافذة، وتغطي مع شريحة زجاجية. اضغط على الزجاج برفق لإجراء اتصال بين الزجاج واللوحة الرأس، وانتظر 10-20 ثانية حتى الاغاروز صلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاغاروز إزالة الزائد من الغطاء الزجاجي باستخدام الملقط والناعمة المناديل الورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صغيركمية من الغراء السريع في جميع أنحاء الزجاج لالغراء الزجاج إلى لوحة الرأس. تنطبق على كمية صغيرة من الاسمنت الأسنان ليصلب الغراء (الشكل 1). </li></ol> 3. حقن في الوريد والدم رصد الأوكسجين ملاحظة: نحن تستخدم بشكل روتيني في الوريد الفخذي للتطبيق في الوريد من أحمر تكساس بدلا من الوريد الذيل. هذا هو بسبب حقن الوريد الفخذي توفير حقن البلعة آمنة وقابلة للتكرار للصباغة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الحيوانية على مدى جزئيا لفضح داخل الفخذ الأيسر. استخدم الشريط لتأمين حيوان في هذا الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فرك مطهر، ثم الإيثانول بنسبة 100٪ على الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق على طول الفخذ الإنسي من الركبة إلى الارتفاق العانة. لينة الأنسجة منفصلة من قبل تشريح حادة باستخدام ملاقط # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء محقنة 1ml مع 130 ميكرولتر من الأحمر تكساس (2.5 ملغ / مل). نعلق إبرة جديدة (قياس 30)، وثنيه بعناية على 30 درجة، والحفاظ على ما يصل شطبة. ملء واي إبرةال حل تكساس الأحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، أدخل الإبرة في الوريد الفخذي وحقن 100 ميكرولتر من الأحمر ولاية تكساس. إزالة الإبرة، ثم اضغط برفق على المنوال مع الشاش لوقف النزيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجلد باستخدام خياطة 4-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمراقبة المستمرة للمكتب التخطيط الاستراتيجي في الدم 2 (لضمان ما يكفي الأوكسجين في الدم) وضع مقياس التأكسج التحقيق في الفخذ الأيمن (من التي تم إزالتها من قبل الشعر). </li></ol> 4. ثنائي الفوتون التصوير ملاحظة: نحن نستخدم Fluoview1000 أوليمبوس نظام التصوير multiphoton (مستقيم) مع الأطياف، الفيزياء MaiTai HP تي الفيمتو ثانية DeepSee: سا الليزر كمصدر للإثارة. للتصوير، ونحن نستخدم × 10 NA 0.45 (زايس C-لامزيغ)، أو 1.05 × 25 NA (أوليمبوس XLPlan N) أهداف مياه الغمر. نحن التقاط صور في 12 بت عمق في القرار 512 × 512 بكسل مع بكسل مدة بقاء من 2 ميكرو ثانية. نحن متحمسون بشكل متزامن NADH وتكساس الأحمر دكستران، في 740 نانومتر، وفلوريتم فصل escence من ضوء الإثارة باستخدام مرآة مزدوج اللون / القريبة من الأشعة تحت الحمراء للحظر الجمع بين مرشح (FF665-Di01؛ FF01-680/SP، Semrock، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) وتنقسم الى مجموعتين القنوات باستخدام مرآة مزدوج اللون (505DCXRU، كروما ، روكينجهام، VT، الولايات المتحدة الأمريكية)، وممر الموجة التي تمت تصفيتها (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). وكانت قوة الليزر قياس بعد الهدف 10-20 ميغاواط للتصوير في طبقة وأنا 20-50 ميغاواط للتصوير في الثانية طبقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس على استعداد جراحيا للمرحلة المجهر. أخذ صورة أولية للموقع نافذة الجمجمة باستخدام مشرق الإضاءة في مجال التكبير 4X لاستخدامها كخريطة مرجعية للتسجيل مع تضخم أعلى اثنين من الفوتون angiographies. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكبير في مجال الاهتمام باستخدام × 10 تكبير. تحديد مساحة من الاهتمام في طبقات القشرة الأول أو الثاني (ما يصل إلى 150 ميكرون تحت سطح حنوني). إذا كان المطلوب تضخم أعلى، واستخدام × 25 هدف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تسجيل سلسلة زمنية (فيقوإعادة 2). نوصي باستخدام متوسط ​​من 3-5 إطارات لزيادة جودة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حث نقص الأكسجة بإضافة N2 50٪ إلى الهواء الذي يتنفس الحيوان. وهذا سيرفع مستوى O2 إلى 10٪. تحقق من نقص الأكسجة خلال رصد البيانات مقياس التأكسج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستمر لتسجيل سلسلة زمنية من خلال نقص الأكسجة (على سبيل المثال، لمدة 30 ثانية)، وبعد استعادة مستوى عادي O2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المعطيات اللازمة لحساب توزيع الأوكسجين عن طريق الكشف والقياس وقياس مجال اسطوانات الأنسجة نقص الأكسجة والاوكسيجين حول الأوعية الدموية. </li></ol> 5. معالجة البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أسطوانة الأنسجة كروغ ر نصف قطرها ويمكن القيام بذلك يدويا (الشكل 3) عن طريق قياس المسافة بين مركز الأوعية الدموية والحدود التي تم الكشف عن ارتفاع NADH مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، استخدم الحسابية محقق مستقل شبه الآلية تحديد دائرة نصف قطرها R الأنسجة اسطوانة والكحول المركزيةOD ص السفينة التي وصفت سابقا 1 في شكل تكميلي وتلخيصها في قسم مناقشة من هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد منطقة من نقص الأكسجة باستخدام مفتوح الوصول لبرنامج تحليل الصور، على سبيل المثال يماغيج. للقيام بذلك، استخدم إشارة NADH، وتحديد عتبة أن يحدد كثافة عالية NADH المنطقة، ومن ثم قياس المنطقة مع ارتفاع مضان الأنسجة NADH. </li></ol> 6. ممثل النتائج ويبين الشكل 2 شريط فيديو من NADH / تصوير الأوعية الصور خلال نقص الأكسجة عابرة (للاطلاع على نسخة PDF من هذا الشكل، وقد استخدمت اختيار الصور الثابتة). تم تخفيض تركيز الأكسجين مستوحاة من 21٪ إلى 10٪ لمدة 3 دقائق. هذا المستوى من نقص الأكسجة الناجم تجريبيا كافية لإحداث نقص الأكسجة الشديد في قشرة الدماغ. أدى نقص الأكسجة إلى زيادة في مضان NADH، في البداية في المناطق التي كانت أبعد من تدفق الدم في الشرايين. لاحظ النسيج NADH حادالحدود، والتي تمثل الحدود الأنسجة يمكن ملاحظتها من انتشار الأكسجين من دوران الأوعية الدقيقة القشرية. الصورة في ويبين الشكل 3 هندسة حدود انتشار الأوكسجين المحيطة الأوعية الدماغية. فمن الممكن أن نستنتج كروغ بأقطار أسطوانات من هذه الحدود، كما هو موضح سابقا 1. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> الشكل 1. (A) الفأر مع نافذة الجمجمة مستعدة للتصوير. (ب) من لوحة الأبعاد الرأس. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> الشكل 2. الذاتية NADH مخضر تصور مع اثنين من الفوتون التصوير من خلال نافذة في الجمجمة، ما يقرب من 50 ميكرومتر تحت سطح حنوني. الأوعية الدموية وتصور مع تكساس الأحمر ديكستران. وانخفض الأوكسجين في الهواء المستنشق إلى 10٪ لمدة 3 دقائق، ثم استعادته ل21٪. شريط الحجم: 50μm. &lt;IMG ALT = &quot;شكل 3&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot; /&gt; الشكل 3. الهندسة الحدود مضان NADH. مخطط يبين حدود أصفر من نقص الأكسجة الوظيفية؛ الدوائر الزرقاء تظهر المتوقع المؤكسج (كروغ) اسطوانات. تظهر خطوط زرقاء كعبرة اسطوانة، تظهر الأرقام كعبرة في ميكرومتر.

<ol>
	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ارتفاع القرار المكانية معلومات حول انتشار الأوكسجين المهم لفهم كيفية تنظيم تدفق الدم في الدماغ لتوفير الأوكسجين إلى خلايا المخ، وتلبية الطلب الأيض. التقليدية قياسات الأكسجين البولاروجرافي باستخدام أقطاب الزجاج كلارك على غرار هي الغازية للغاية ويكون القرار المكانية منخفضة 2-3 و كبيرة (مجموعة 2) زمن الاستجابة. حتى الآن الدولة الوحيدة غير الغازية طريقة لقياس ص 2 في أنسجة المخ تروي تفسفر، حيث يبلغ معدل تسوس لجنة التحقيق متحمس يتناسب مع تركيز الأكسجين 4. هذه الطريقة توفر تركيزات الأكسجين دقيقة، ولكن يتطلب صبغة الملكية ومتطورة تقنيا التصوير عمر نظام تفسفر. هنا، نحن يبرهن على وجود بسيط، بساطة النهج الذي يمكن أن تجرى على نظام معيار التصوير ثنائي الفوتون مع قناتين flurescence. نهجنا يستفيد من إشارة الأنسجة الجوهرية 5 (أ)الثاني يتطلب سوى تصور مغاير للدوران الأوعية الدقيقة القشرية. نظرا للزيادة، غير الخطية الثنائية أساسا من مضان NADH في الحد من وظيفيا تركيزات الأكسجين 1، زيادة جوهرية NADH مضان ويلاحظ فقط في المناطق التي توجد فيها نقص الأكسجة أيضي كبير، مما يحد. ملمحة المهم هو أن يتم ملاحظتها مباشرة الحدود الأنسجة من انتشار الأوكسجين من microvessels القشرية بسبب التغيرات شدة على شكل cylindrically من مضان NADH الذاتية. نشير إلى هذه الهياكل واسطوانات كروغ، لأنه تم عرض مفهوم هياكل على شكل cylindrically التي تحدد حجم الاوكسيجين من الأنسجة المحيطة بها وعاء دموي من قبل كروغ أغسطس ولقد تم في الآونة الأخيرة لوحظ تجريبيا باستخدام اثنين من الفوتون NADH التصوير 1. ويمكن جمع كروغ اسطوانات الصور في 3D من خلال اتخاذ Z-كومة من إطارات الصور. فهي بارزة خصوصا في المناطق القريبة من الشرايين اختراق وهم خفة دم مطابقح الشعرية المنضب محيط بالشرين الأنسجة اسطوانات 1،4. لتقديم تقرير موضوعي للR الأنسجة كروغ دائرة نصف قطرها أسطوانة (انظر القسم 5.2) ونحن على قياس كثافة بكسل شعاعي القيم داخل شريحة واضحة المعالم بين مركز الاسطوانة والحدود الخارجية باستخدام وظيفة مطلب &quot;improfile&quot;. وينبغي اختيار الحدود الخارجية للقطاع لتمديد مع هامش أمان خارج حدود مرئية. لتحسين مستوى إشارة إلى الضجيج averageed نحن على جميع الخطوط الشعاعية اللازمة لتغطية الجزء المرئي الاسطوانة في الخطوات رقم 1. أظهر الناتج الملف متوسط ​​كثافة شعاعي داخل قطعة زيادة حادة والتي تتوافق مع R الأنسجة حدود واضحة. ونحن تناسب وظيفة السيني (على سبيل المثال بولتزمان وظيفة) إلى الوضع كثافة شعاعي المتوسط ​​وتستخدم نقطة انعطاف (المعروف أيضا باسم س 0) كتعريف للبحث. في المقابل 2-Pوكشفت hoton microangiography (تكساس الحمراء) في المقطع العرضي وعاء دموي مركزي الانفرادي في مركز الأسطوانة. ويمكن القطر من الأوعية الدموية المركزية تطبيقها مباشرة لتحديد ص. ثنائي الفوتون NADH التصوير يوفر نفس القرار المكانية والتصوير ذات الدقة العالية المتزامنة للmicroangiography القشرية. ميزة هامة لتطبيق الكمي لهذا الأسلوب هو أنه تم قياس ص 50 من الزيادة في مضان NADH أن يكون من 3.4 ± 0.6 ملم زئبق (1) والتي يمكن أن كثافة NADH مضان بوصفها وظيفة من الأنسجة microregional ص 2 صفها رياضيا مع وظيفة السيني. . نظهر أن هذا الأسلوب يسمح احد لتحديد مناطق الدماغ التي هي الأكثر عرضة لنقص الأكسجة (من خلال خفض محتوى الأوكسجين في الهواء الى 10٪). علينا أن نبين أن انتشار الأوكسجين يتبع نمط بسيط حول الوعاء هندسية. واحد الحرجةخطوة كال لهذا الأسلوب هو نوعية إعداد نافذة في الجمجمة. وينبغي لعملية جراحية إنتاج أضرار طفيفة حتى لا تعكر صفو تدفق الدم الى منطقة مكشوفة. والقلق هو أنه في التحضير للخطر جراحيا، والقشرة تحت النافذة قد تكون ميتة لتبدأ، ويحول دون أي تجارب ذات مغزى. وينبغي أن يكون نافذة معدة إعدادا جيدا في الجمجمة لديها سليمة الأوعية الدموية الرئيسية والثانوية مع تدفق الدم حية في جميع أنواع السفن وعدم وجود نزيف كبير على طول الحواف. في ظل ظروف normoxic (80-100 مم زئبق PaO2، ​​SP O2 97-99٪) وينبغي لحمة الدماغ يحمل موحد، ومضان NADH متجانس من دون واضح، والبقع الأنسجة مشرق مع مضان NADH مرتفعة. ويقتصر ومن بين القيود الأساسية المادية لنهجنا اختراق العمق. ومضان NADH الأخضر والأزرق في الدماغ هو الموهن بسرعة عن طريق امتصاص الهيموغلوبين والتشرذم في نسيج هذه الموجات. حتى مع فتحة عددية عالية (على سبيل المثال 1.05) للمياهأهداف غمر يقتصر حاليا اثنين من الفوتون NADH التصوير لأنني الطبقات القشرية والثاني. هذا القيد المختصة علميا لاستقلاب الطاقة في أو في القرب من المادة البيضاء سوف تختلف على الأرجح من المادة الرمادية. ومع ذلك، فإن التحقيق في الهياكل القشرية العميقة مثل السادس الى الرابع طبقات أو هياكل تحت القشرية مثل مساحات المادة البيضاء أو المخطط وتتطلب استخدام microlenses المتخصصة كما هو موضح في قشرة الماوس في الجسم الحي 6. يمكن NADH مقرها قياس حدود انتشار الأوكسجين تكون مفيدة خصوصا عندما يقترن قياسات أخرى مثل تحليلات تبيغ وظيفي، والكشف عن معدلات تدفق شعري 7. على سبيل المثال، يمكن تكييف هذه التقنية لتصور نقص الأكسجة في السكتة الدماغية ومرض الزهايمر (AD) نماذج. هندسة بسيطة من انتشار الأوكسجين يسمح لأحد أن يتنبأ التدرج الأوكسجين في سرير الاوعية الدموية الدقيقة تحت الظروف التي تكون فيها كثافة الشعيرات الدموية هي ديمجعد 8 (على سبيل المثال، م 9)، وإلى دراسة ما إذا كانت مناطق أنسجة المخ مع انخفاض الكثافة الشعرية هي في خطر متزايد للتلف بسبب نقص الأكسجة microstrokes. القدرة على صورة microregionally يسمح أيضا واحدة لدراسة الهندسة وحجم microstrokes الأنسجة وتحديد حجم الأنسجة التي يحدث نقص الأكسجة، وكذلك العلاقة بين نقص الأكسجة الأنسجة وموت الخلايا العصبية اللاحقة أو إعادة عرض شعري 10. أخيرا، منذ زيادات في مضان NADH الذاتية هي نتيجة مباشرة لضعف الميتوكوندريا الحادة، وهذا الأسلوب يخلق الفرصة لاستخدام NADH التصوير كمراسلة محددة لاستقلاب الطاقة العصبية 11 وكيل لضعف الميتوكوندريا. في الختام، واثنين من الفوتون التصوير من مضان NADH الذاتية هو بسيط، وأداة المتساهلة التي يمكن استخدامها لفهم تسليم الأوكسجين والاستهلاك في الدماغ على حد سواء تحت العاديوفي الولايات مرضية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr valign="top"><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> التدفئة منصات </td><td> وراء Bodi الحرارة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مرهم للعين (الدموع الاصطناعية) </td><td> فايزر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> محلول البوفيدون اليودي 10٪ </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> محلول كلوريد الحديديك 10٪ </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> أسمنت </td><td> Stoelting الشركة </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanoacrylate 454 </td><td> وكتايت </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> هارفارد جهاز </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque الثاني قبضة عدة </td><td> بيرسون </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> بت IRF 007 الحفر </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط # 5 </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط # 5/45 </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 زجاج ساترة </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> أنبوب مضخم للضوء </td><td> هاماماتسو </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> منظمة الشفافية الدولية: ليزر الياقوت الماي تاي </td><td> الأطياف، الفيزياء </td><td> &amp;نبسب؛ </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

قدرة الدماغ على العمل بمستويات عالية من الطلب على التمثيل الغذائي يعتمد على امدادات الاوكسجين المستمر من خلال تدفق الدم والأنسجة انتشار الأوكسجين. هنا نقدم لبروتوكول تصور التجريبية والمنهجية لتصور مباشرة microregional نقص الأكسجة الأنسجة والاستدلال التدرجات الأوكسجين حول الوعاء في القشرة الماوس. لأنه يقوم على العلاقة غير الخطية بين الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد (NADH) كثافة مضان الداخلية وضغط الأكسجين الجزئي في الأنسجة، حيث لوحظ الأنسجة NADH مضان يزيد بشكل مفاجئ في مستويات الأكسجين في الأنسجة أقل من 10 مم زئبق 1. نحن نستخدم اثنين من الفوتون الإثارة في 740 نانومتر الذي يسمح لإثارة المتزامنة من جوهري مضان الأنسجة NADH وبلازما الدم يتناقض مع تكساس الأحمر ديكستران. مزايا هذه الطريقة على النهج القائمة تشمل ما يلي: أنه يستفيد من إشارة الأنسجة الذاتية ويمكن أن يؤديها باستخدام معيار ثنائي الفوتون في الدردشة الحيةالشيخوخة المعدات، ويسمح المراقبة المستمرة في المجال الكامل للرأي مع قرار عمق ميكرون 50 ~. علينا أن نبرهن على مناطق أبعد من أنسجة المخ الأوعية الدموية الدماغية تتوافق مع مناطق مستجمعات المياه الضعيفة التي هي الاولى لتصبح ميتة وظيفيا في أعقاب انخفاض نسبة الأوكسجين في الأوعية الدموية. هذا الأسلوب يسمح لأحد أن الأوكسجين صورة القشرية microregional وبالتالي فهو مفيد للنظر في دور غير كافية أو تقييد امدادات الاوكسجين في الأنسجة الأمراض الوعائية العصبية والسكتة الدماغية.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence at JoVE.com

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

نحن هنا وصف طريقة لتصور مباشرة microregional نقص الأكسجة الأنسجة في القشرة الماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. لأنه يقوم على التصوير ثنائي الفوتون المتزامنة من الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد (NADH) ودوران الأوعية الدقيقة القشرية. هذه الطريقة مفيدة لتحليل قرار عالية من الأوكسجين الأنسجة.

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

التصوير الوظيفي للسمعي اللحاء في القطط الكبار باستخدام الحقل عالي الرنين المغناطيسي الوظيفي

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...