Name: detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00
Duration: 12 min 3 s
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हम सिर थाली डिजाइन के लिए हैं डा. Maiken Nedergaard (रोचेस्टर मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय) धन्यवाद. एसडी (R01DA026325 और P30AI078498 और नींव (दाना नींव ब्रेन और Immunoimaging कार्यक्रम, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 0635595T और ए एल एस एसोसिएशन [1112 #)] के.के. अनुदान) के लिए काम किया गया है के एनआईएच पुरस्कार द्वारा समर्थित है.

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	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.

उच्च स्थानिक संकल्प जानकारी ऑक्सीजन प्रसार के बारे में समझ कैसे मस्तिष्क में रक्त के प्रवाह को नियंत्रित किया जाता है मस्तिष्क की कोशिकाओं को ऑक्सीजन प्रदान करते हैं, और चयापचय की मांग को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है. परंपरागत polarographic ऑक्सीजन क्लार्क शैली कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग माप अत्यधिक आक्रामक हैं और कम स्थानिक संकल्प 2-3 और (द्वितीय श्रेणी) महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया समय है. अब तक केवल मस्तिष्क के ऊतकों में PO 2 को मापने के लिए गैर इनवेसिव विधि स्फुरदीप्ति शमन, जहां उत्साहित जांच के क्षय की दर 4 ऑक्सीजन एकाग्रता के लिए आनुपातिक है. यह विधि सही ऑक्सीजन सांद्रता प्रदान करता है, लेकिन एक मालिकाना डाई और तकनीकी रूप से परिष्कृत स्फुरदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता है. यहाँ, हम एक सीधा, सरल दृष्टिकोण है कि दो flurescence चैनल के साथ एक मानक दो photon इमेजिंग प्रणाली पर आयोजित किया जा सकता है प्रदर्शित करता है. हमारा दृष्टिकोण एक आंतरिक ऊतक 5 संकेत एक का लाभ लेता हैएन डी ही cortical microcirculation की विषम दृश्य की आवश्यकता है. गैर रेखीय, कार्यात्मक ऑक्सीजन सांद्रता एक सीमित पर NADH प्रतिदीप्ति अनिवार्य रूप से द्विआधारी वृद्धि की वजह से, आंतरिक NADH प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है महत्वपूर्ण, metabolically सीमित hypoxia के साथ क्षेत्रों में ही मनाया. एक महत्वपूर्ण निहितार्थ यह है कि ऊतक में cortical microvessels से ऑक्सीजन प्रसार की सीमाओं सीधे cylindrically आकार अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की तीव्रता में परिवर्तन के द्वारा प्रत्यक्ष कर रहे हैं. हम Krogh सिलेंडरों के रूप में इन संरचनाओं को देखें, क्योंकि cylindrically आकार का संरचनाओं कि एक रक्त वाहिका आसपास के ऊतकों की ऑक्सीजन की मात्रा को परिभाषित की अवधारणा अगस्त Krogh द्वारा शुरू की गई थी और हाल ही में प्रयोगात्मक दो photon NADH एक इमेजिंग का उपयोग कर देखा. Krogh सिलेंडर छवियों छवि फ्रेम के z-ढेर लेने से 3 डी में एकत्र किया जा सकता है. वे मर्मज्ञ arterioles के आसपास के क्षेत्र में विशेष रूप से प्रमुख हैं और वे मुताबिक़ बुद्धिघंटे से समाप्त periarteriolar ऊतक सिलेंडर 1,4 केशिका. Krogh ऊतक सिलेंडर त्रिज्या आर के एक उद्देश्य निर्धारण (खंड 5.2 देखें) हम अच्छी तरह से परिभाषित सिलेंडर के केंद्र और बाहरी सीमा Matlab समारोह &quot;improfile का उपयोग कर के बीच एक खंड के भीतर उनके रेडियल पिक्सेल तीव्रता मूल्यों मापा प्रदान करते हैं. खंड की बाहरी सीमा दृश्य सीमा से परे एक सुरक्षा मार्जिन के साथ विस्तार करने के लिए चुना जाना चाहिए. संकेत से शोर के स्तर में सुधार हम सभी रेडियल 1 ° चरणों में दिखाई सिलेंडर खंड को कवर करने के लिए की जरूरत लाइनों पर averageed. खंड के भीतर जिसके परिणामस्वरूप मतलब रेडियल तीव्रता प्रोफ़ाइल एक तेजी से वृद्धि हुई है जो दिखाई ऊतक सीमा आर करने के लिए corresponded प्रदर्शन किया. हम औसत रेडियल तीव्रता प्रोफ़ाइल एक sigmoidal समारोह के (जैसे बोल्ट्जमान समारोह) फिट और आर के एक परिभाषा के रूप में इसके मोड़ बिंदु (0 एक्स के रूप में भी जाना जाता है) का इस्तेमाल किया. इसी दो - पीhoton microangiography (टेक्सास लाल) सिलेंडर के केंद्र में एक एकान्त केंद्रीय रक्त वाहिका के पार अनुभाग का पता चला. केंद्रीय रक्त वाहिका के व्यास सीधे आर निर्धारित करने के लिए लागू कर सकते हैं. दो photon NADH इमेजिंग को cortical microangiography की समवर्ती उच्च संकल्प इमेजिंग के रूप में एक ही स्थानिक संकल्प प्रदान करता है. इस विधि का मात्रात्मक आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि पी 50 NADH प्रतिदीप्ति वृद्धि की 3.4 का होना मापा गया है ± 0.6 मिमी 1 पारा और कि microregional ऊतक 2 पुलिस के एक समारोह के रूप में NADH प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ गणितीय में वर्णित किया जा सकता है एक sigmoidal समारोह. . हम बताते हैं कि इस तकनीक से एक जो सबसे करने के लिए hypoxia के (10% करने के लिए हवा में ऑक्सीजन सामग्री कम) की चपेट में हैं मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान करने की अनुमति देता है. हम यह भी पता चलता है कि ऑक्सीजन प्रसार एक सरल ज्यामितीय perivascular के पैटर्न के बाद है. एक critइस विधि के लिए राजनैतिक कदम कपाल खिड़की तैयारी की गुणवत्ता है. सर्जरी कम से कम क्षति का उत्पादन क्रम में उजागर क्षेत्र में रक्त के प्रवाह को परेशान नहीं करना चाहिए. एक चिंता का विषय है कि एक शल्य चिकित्सा समझौता तैयार करने में, खिड़की के नीचे प्रांतस्था के साथ शुरू करने के hypoxic, किसी भी सार्थक प्रयोगों precluding. पोत के सभी प्रकार में उज्ज्वल रक्त प्रवाह और किनारों के साथ कोई महत्वपूर्ण खून बह रहा है के साथ एक अच्छी तरह से तैयार कपाल खिड़की बरकरार बड़ी और छोटी रक्त वाहिकाओं होना चाहिए. Normoxic शर्तों के तहत (PaO2 80-100 mmHg, सपा O2 97-99%) मस्तिष्क पैरेन्काइमा विशिष्ट ऊंचा NADH प्रतिदीप्ति साथ उज्ज्वल ऊतक पैच बिना वर्दी, सजातीय NADH प्रतिदीप्ति एक्ज़िबिट चाहिए. हमारे दृष्टिकोण का एक मूलभूत भौतिक बाधा गहराई पैठ सीमित है. मस्तिष्क में नीली हरी NADH प्रतिदीप्ति तेजी से हीमोग्लोबिन और इन तरंगदैर्य पर ऊतक बिखरने अवशोषण द्वारा तनु है. यहां तक ​​कि उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ पानी (1.05 उदा)विसर्जन उद्देश्यों दो photon NADH इमेजिंग वर्तमान में cortical परतों मैं और द्वितीय के लिए सीमित है. इस सीमा को वैज्ञानिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि या सफेद बात के लिए निकटता में ऊर्जा चयापचय की संभावना ग्रे मामले से अलग होगा. हालांकि, ऐसी परतों चतुर्थ छठी या सफेद बात इलाकों या striatum जैसे subcortical संरचनाओं के रूप में गहरे cortical संरचनाओं की जांच विशेष रूप से 6 vivo में माउस प्रांतस्था में वर्णित microlenses के उपयोग की आवश्यकता होगी. NADH आधारित ऑक्सीजन प्रसार सीमाओं की माप विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब कार्यात्मक hyperemia, और केशिका प्रवाह दर का पता लगाने के 7 के विश्लेषण के रूप में अन्य माप के साथ संयुक्त कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, इस तकनीक स्ट्रोक और अल्जाइमर रोग (ई.) मॉडल में hypoxia कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. ऑक्सीजन प्रसार की सरल ज्यामिति परिस्थितियों जहां केशिका घनत्व है के तहत में microvascular बेड में ऑक्सीजन ढाल की भविष्यवाणी करने के लिए अनुमति देता है8 (जैसे, 9 ई.) वृद्धि और जांच करने के लिए कि कम केशिका घनत्व के साथ मस्तिष्क ऊतक क्षेत्रों hypoxia के microstrokes के लिए वजह से नुकसान के लिए बढ़ा जोखिम में हैं. छवि के लिए क्षमता microregionally भी एक ज्यामिति और ऊतक microstrokes के आकार की जांच करने के लिए और ऊतकों की मात्रा में hypoxia होती निर्धारित की अनुमति देता है, के रूप में अच्छी तरह से ऊतक hypoxia और बाद neuronal मौत या केशिका remodeling के 10 के बीच संबंध. अंत में, अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति में वृद्धि के बाद से तीव्र mitochondrial रोग के प्रत्यक्ष परिणाम हैं, तो इस विधि NADH इमेजिंग के तंत्रिका ऊर्जा 11 चयापचय और mitochondrial रोग के लिए एक प्रॉक्सी के लिए एक विशेष संवाददाता के रूप में उपयोग करने का अवसर पैदा करता है. अंत में, अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की दो photon इमेजिंग एक सरल, सादा उपकरण है कि दोनों सामान्य के तहत ऑक्सीजन और मस्तिष्क में वितरण की खपत को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैऔर वैकृत राज्यों में.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> अभिकर्मक का नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> हीटिंग पैड </td><td> बोडी हीट से परे </td><td></td><td></td></tr><tr><td> नेत्र मरहम (कृत्रिम आँसू) </td><td> फ़िज़र </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidone-आयोडीन 10% समाधान </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ferric क्लोराइड 10% समाधान </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> सीमेंट </td><td> कंपनी Stoelting </td><td> 51,456 </td><td></td></tr><tr><td> 454 cyanoacrylate </td><td> लॉकटाइट </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> हार्वर्ड उपकरण </td><td> 597,316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque द्वितीय handpiece किट </td><td> Pearson के </td><td> R14-०,००२ </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 ड्रिल बिट </td><td> ठीक विज्ञान उपकरण </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 संदंश </td><td> ठीक विज्ञान उपकरण </td><td> 11,295 </td><td></td></tr><tr><td> 45 / # 5 संदंश </td><td> ठीक विज्ञान उपकरण </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> कांच coverslip 0 </td><td> इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Photomultiplier ट्यूब </td><td> हामामत्सु </td><td> HC125 - 02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> तिवारी: नीलम लेजर माई - ताई </td><td> स्पेक्ट्रा - भौतिकी </td><td> औरnbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

मस्तिष्क चयापचय मांग की उच्च स्तर पर कार्य करने की क्षमता के रक्त प्रवाह और ऊतकों को ऑक्सीजन प्रसार के माध्यम से निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति पर निर्भर करता है. यहाँ हम एक कल्पना प्रयोगात्मक और methodological को सीधे microregional ऊतक hypoxia के कल्पना और के माउस प्रांतस्था में perivascular ऑक्सीजन ढ़ाल अनुमान प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह गैर रेखीय nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) अंतर्जात प्रतिदीप्ति तीव्रता और ऑक्सीजन ऊतक, जहां मनाया ऊतक NADH प्रतिदीप्ति अचानक 10 mmHg एक नीचे ऊतक ऑक्सीजन के स्तर पर बढ़ जाती है में आंशिक दबाव के बीच संबंध पर आधारित है. हम 740 एनएम जो आंतरिक NADH ऊतक प्रतिदीप्ति और रक्त प्लाज्मा टेक्सास रेड dextran के साथ विषम के समवर्ती उत्तेजना के लिए अनुमति देता है पर दो photon उत्तेजना का उपयोग करें. मौजूदा तरीकों पर इस विधि के लाभ में निम्नलिखित शामिल हैं: यह एक आंतरिक ऊतक संकेत का लाभ लेता है और vivo में im में दो photon मानक का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता हैउम्र बढ़ने के उपकरण, यह देखने के पूरे क्षेत्र में ~ 50 माइक्रोन की गहराई संकल्प के साथ सतत निगरानी करने की अनुमति देता है. हम दिखाना है कि मस्तिष्क के ऊतकों को मस्तिष्क में रक्त वाहिकाओं से दूर क्षेत्रों के अनुरूप कमजोर जलग्रहण क्षेत्रों में जो संवहनी ऑक्सीजन की आपूर्ति में गिरावट के बाद कार्यात्मक hypoxic बनने के लिए पहली बार कर रहे हैं. इस विधि छवि microregional cortical oxygenation में एक की अनुमति देता है और इसलिए neurovascular रोगों और स्ट्रोक में अपर्याप्त या प्रतिबंधित ऊतकों को ऑक्सीजन की आपूर्ति की भूमिका की जांच के लिए उपयोगी है.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

यहाँ हम एक विधि का वर्णन करने के लिए सीधे माउस प्रांतस्था में microregional ऊतक hypoxia के कल्पना<em&gt; Vivo में</em&gt;. यह nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) और प्रांतस्था microcirculation की समवर्ती दो photon इमेजिंग पर आधारित है. इस विधि के ऊतकों को ऑक्सीजन की आपूर्ति के उच्च संकल्प विश्लेषण के लिए उपयोगी है.

माउस प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में Microregional Hypoxia की अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की दो photon इमेजिंग द्वारा जांच

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