Name: detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence at JoVE.com

Мы благодарим доктора Maiken Nedergaard (Университет Рочестера медицинский центр) для проектирования пластины голову. Работа была поддержана награды NIH для SD (R01DA026325 и P30AI078498 и грантов фонда выделяется KK (DANA основу мозга и Immunoimaging программы Американской ассоциации сердца 0635595T и ассоциации БАС [# 1112)]).

<ol>
	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Высокое пространственное разрешение информация о диффузии кислорода важно для понимания того, как поток крови в мозг регулируется обеспечить кислородом клеток мозга, и для удовлетворения метаболических спроса. Традиционные полярографического измерения кислорода с помощью Кларк стиль стеклянные электроды обладают высокой инвазивной и имеют низкое пространственное разрешение 2-3 и значительным (второй круг), время отклика. До сих пор единственным неинвазивным методом измерения рО 2 в тканях головного мозга является тушение фосфоресценции, где скорость распада возбужденного зонда пропорциональна концентрации кислорода 4. Этот метод обеспечивает точные концентрации кислорода, но требует собственного красителей и технически сложных фосфоресценции системы визуализации жизни. Здесь мы показываем, простой, простой подход, который может быть проведено на стандартном двухфотонного визуализации системы с двумя flurescence каналов. Наш подход использует внутренний сигнал ткани 5м требуется только контрастной визуализации коры микроциркуляцию. Из-за нелинейной, по сути двоичный увеличение NADH флуоресценции на функционально предельной концентрации кислорода 1, увеличился внутренний NADH флуоресценции наблюдается только в районах со значительным, метаболически ограничивающий гипоксии. Важным следствием является то, что ткань границы диффузии кислорода из коры микрососудов непосредственно наблюдаемые цилиндрической формы интенсивность изменения эндогенной флуоресценции NADH. Мы называем эти структуры в виде цилиндров Крог, потому что понятие цилиндрические структуры, которые определяют объем кислородом ткани, окружающие кровеносные сосуды был введен Август Крог и недавно была экспериментально наблюдаемые с помощью двухфотонного NADH изображений 1. Крог цилиндров изображения могут быть собраны в 3D с Z-Stack кадров изображения. Это особенно заметно в окрестностях проникающих артериол и они конгруэнтны остроумиеч капилляр обедненного periarteriolar тканевых цилиндров 1,4. Для обеспечения объективного определения ткани Крог цилиндр радиусом R (см. раздел 5.2), мы измерили их радиальных значений интенсивности пикселей в пределах четко определенных сегментов между центром цилиндра и внешней границы с помощью функции Matlab &quot;improfile&quot;. Внешняя граница сегмента должна быть выбрана расширить с запасом за пределы видимой границы. Для улучшения отношения сигнал-шум уровне мы averageed над всеми радиальными линиями, необходимых для покрытия видимый сегмент цилиндра с шагом 1 °. В результате средний радиальный профиль интенсивности в сегменте выставляются резкое увеличение которого соответствовала видимой границы R ткани. Мы соответствуем сигмоидального функции (например, функции Больцмана) для усредненного радиального профиля интенсивности и использовать ее точка перегиба (также известный как х 0), определение R. Соответствующие два рhoton microangiography (Техас-красный) показал сечения одиночных центральных сосудов в центре цилиндра. Диаметр центрального кровеносного сосуда могут быть непосредственно применены для определения р. Двухфотонного NADH изображения обеспечивает те же пространственным разрешением одновременных изображений с высоким разрешением корковой microangiography. Важной особенностью для количественного применения этого метода является то, что с 50 NADH флуоресценции увеличение было измерено, 3,4 ± 0,6 мм рт 1, а интенсивность флуоресценции NADH в зависимости от ткани микрорегиональном рО 2 может быть математически описана сигмоидального функции. . Мы показываем, что этот метод позволяет выявить области мозга, которые являются наиболее уязвимыми к гипоксии (за счет уменьшения содержания кислорода в воздухе до 10%). Мы также показали, что диффузия кислорода следующим простым геометрическим рисунком периваскулярных. Один критческих шагом для этого метода является качество подготовки черепной окна. Операция должна производить минимальные повреждения, чтобы не нарушать кровоток в пораженном участке. Беспокоит то, что в хирургически под угрозу подготовку, коры под окном может быть гипоксической Начнем с того, исключающих любые значимые эксперименты. Хорошо подготовленные черепной окно должно иметь нетронутой крупных и мелких сосудов с яркими кровотока во всех типов судов и никаких существенных кровотечений по краям. Под гипоксическим условиям (PaO2 80-100 мм рт.ст., Sp O2 97-99%) паренхимы мозга должны обладать равномерным, однородным флуоресценции NADH без заметных, ярких пятен ткани с повышенной флуоресценции NADH. Фундаментальные физические ограничения нашего подхода ограничена глубиной проникновения. Сине-зеленый NADH флуоресценции в мозг быстро ослабляется поглощения гемоглобина и тканей рассеяния на этих длинах волн. Даже при высокой числовой апертурой (например, 1.05) водыпогружение целей двухфотонного NADH изображений в настоящее время ограничивается корковых слоев я и II. Это ограничение научно значение, поскольку энергетический обмен или в непосредственной близости от белого вещества, вероятно, отличается от серого вещества. Тем не менее, исследование глубоких корковых структур, таких как слои IV-VI и подкорковых структур, таких как трактов белого вещества или стриатума потребует использования специальных микролинз, как описано в мышь коры в естественных условиях 6. NADH на основе измерения границы диффузии кислорода может быть особенно полезна в сочетании с другими измерениями, такие как анализ функциональной гиперемии и обнаружения капиллярной ставки потока 7. Например, этот метод может быть адаптирован для визуализации гипоксии инсульта и болезни Альцгеймера (AD) модели. Простая геометрия диффузии кислорода позволяет прогнозировать кислорода градиент микрососудистых кровати в условиях, когда плотность капилляров де-увеличился 8 (например, в 9 г. н.э.), а также изучить вопрос о мозговой ткани регионов с пониженной плотности капилляров находятся в группе повышенного риска гипоксии повреждения в результате microstrokes. Возможность изображение microregionally также позволяет изучить геометрию и размер тканей microstrokes и определения объема тканей, в которых происходит гипоксия, а также отношения между тканевой гипоксии и последующей гибели нейронов или капиллярной реконструкции 10. Наконец, так как увеличение эндогенной флуоресценции NADH являются прямым следствием острого митохондриальная дисфункция, этот метод создает возможность использовать NADH изображений в качестве конкретного корреспондента нейронных энергетического метаболизма 11 и прокси-сервер для митохондриальная дисфункция. В заключение двухфотонного изображения эндогенной флуоресценции NADH является простой, нетребовательный инструмент, который может быть использован, чтобы понять доставки и потребления кислорода в мозге, как при нормальных,и патологических состояний.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (опционально) </td></tr><tr><td> Электрогрелки </td><td> За тепло Боди </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Офтальмологическая мазь (искусственные слезы) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Повидон-йод 10% раствор </td><td> Бетадин </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Хлорид железа 10% раствор </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Цемент </td><td> Stoelting компании </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Цианакрилатный 454 </td><td> Локтайт </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Гарвардский аппарата </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II наконечник комплект </td><td> Пирсон </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 бит сверла </td><td> Изобразительных средств наук </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Пинцет # 5 </td><td> Изобразительных средств наук </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Пинцет # 5/45 </td><td> Изобразительных средств наук </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 стекло покровное </td><td> Электронная микроскопия наук </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Фотоумножитель </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Sapphire лазер Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> ИNBSP; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

Способность мозга функционировать на высоком уровне метаболических спрос зависит от того, непрерывную подачу кислорода через кровоток и диффузии кислорода в тканях. Здесь мы представляем визуализировать экспериментальной и методической протокол непосредственно визуализировать микрорегиональном гипоксии тканей и вывести периваскулярных градиента кислорода в коре мыши. Он основан на нелинейных отношений между никотинамидадениндинуклеотида (NADH) эндогенные интенсивности флуоресценции и парциальное давление кислорода в ткани, где наблюдается ткани NADH флуоресценции резко возрастает в ткани кислорода ниже 10 мм рт.ст. 1. Мы используем двухфотонного возбуждения при 740 нм, что позволяет одновременное возбуждение собственных тканей NADH флуоресценции и плазме крови контрастирует с Техасе Красной декстран. Преимущества этого метода по сравнению с существующими подходами, включают следующее: он использует внутренний сигнал ткани и может быть выполнена с использованием стандартных двухфотонного в естественных условиях имстарением оборудования, она позволяет непрерывный мониторинг во всем поле зрения с глубиной разрешением ~ 50 мкм. Мы показали, что ткани мозга областях удаленных от кровеносных сосудов мозга соответствуют уязвимых водосборных бассейнов, которые первыми становятся функционально гипоксического после снижения сосудистого снабжения кислородом. Этот метод позволяет изображение микрорегиональном коры кислородом и, следовательно, полезны для изучения роли неадекватной или ограниченного питания тканей кислородом, в нервно-сосудистых заболеваний и инсульта.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence at JoVE.com

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Здесь мы опишем метод непосредственно визуализировать микрорегиональном тканевой гипоксии у мышей коры<em&gt; В естественных условиях</em&gt;. Она основана на одновременных двухфотонного изображений никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и корковых микроциркуляцию. Этот метод полезен для получения высокого разрешения ткани кислорода.

Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Функциональной визуализации из слуховой коры у взрослых кошек с использованием высокого поля МРТ

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Одновременная Двухфотонное<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Количественная оценка церебральной сосудистой архитектуры с использованием двухфотонного микроскопии в мышиной модели ВИЧ-индуцированной нейровоспаление

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

В естественных условиях Двух фотонных изображений корковых нейронов в новорожденных мышей

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Транспупиллярная двухфотонная визуализация сетчатки мыши In vivo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...