Name: detection of protein interactions in plant using a gateway compatible bimolecular fluorescence complementation (bifc) system
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System at JoVE.com

אנו מודים וי נגוין לקרוא את כתב היד וסיוע מעבדה כללית.

1. הכנת תרבות Agrobacterium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agrobacterium זן GV3101 שינתה בעבר עם Gateway תואם BiFC וקטור pEarleyGate201-י&quot;ס pEarleyGate202 ו-YN, שכל אחת מהן מכילה היתוך לבנות של GOI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מ&quot;ל ייב (5 גרם ל -1 תמצית בשר בקר, 1g ל ...

<ol>
	<li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li><li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions.">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li><li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li><li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+in+yeast.">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis.">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li><li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li><li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex:+components+and+anchoring+nucleoporin.">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants.">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li><li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells:+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs.">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li><li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization.">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li></ol>

Assay BiFC הוא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון. בניגוד assay Y2H המסורתית, BiFC לא רק מאפשר הדמיה של חלבונים אינטראקציות, אלא גם מספק מידע יותר מורכב החלבון כגון בלוקליזציה המשנה הסלולר. כמו כן, ניתן לזהות אינטראקציות עקיפה, כל עוד שני חלבונים מועמד אפשר להביא מספיק קרוב על י...

<table border='1'>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL slip-tip tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309602</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein interactions in plant using a gateway compatible bimolecular fluorescence complementation (bifc) system

פיתחנו טכניקה BiFC לבחון את האינטראקציה בין שני חלבונים in vivo. מטרה זו מושגת על ידי פיצול חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לשני שברים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן של עניין. מבנים אלה אז יכול להיות שותף להפוך ניקוטיאנה benthamiana דרך טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium, המאפשר ביטוי במעבר של חלבונים היתוך. הכינון מחדש של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה 1-7. כדי לבדוק ולאמת את חלבונים אינטראקציות, BiFC ניתן להשתמש יחד עם שני assay שמרים (Y2H) היברידית. זה יכול לזהות אינטראקציות עקיף אשר ניתן להתעלם ב Y2H. הטכנולוגיה Gateway היא פלטפורמה אוניברסאלית המאפשרת לחוקרים המעבורת הגן של עניין (GOI) לתוך כביטוי רבים מערכות אנליזה פונקציונלית כמו 8,9 אפשרי. גם הכיוון ואת מסגרת הקריאה יכול להישמר ללא שימוש אנזימי הגבלה או קשירת להפוך מוכנים ביטוי שיבוטים. כתוצאה מכך, אפשר לחסל את כל סידור מחדש של צעדים כדי להבטיח תוצאות עקביות לאורך הניסויים. יצרנו סדרה של וקטורים BiFC תואם Gateway ו Y2H אשר לספק לחוקרים עם קל להשתמש בכלים כדי לבצע מבחני הן BiFC ו Y2H 10. כאן, אנו להדגים את קלות השימוש במערכת BiFC שלנו לבדוק חלבונים אינטראקציות נ benthamiana צמחים.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System at JoVE.com

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...