Name: propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Ce travail a été financé par le Fonds de recherche en islandais et l&#39;Université d&#39;Islande Fonds pour la recherche.

1. La transfection Le clone moléculaire est contenue dans deux plasmides, p8XSp5-EGFP et p67r, de 12 kb et 4,5 kb, respectivement 9,10. <ol><li> Couper des quantités équimolaires de deux plasmides, soit 4,4 mg d&#39;p8XSp5-EGFP et 1,6 mg d&#39;p67r par XbaI et ligaturer avant la transfection. </li><li> Pour la ligature, utilisez une unité de Weiss de ligase dans une réaction de 50 ul et incuber à 16 ° C pendant la nuit. </li><li> Lorsque la ligature est terminée, incuber...

<ol>
	<li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna,+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep.">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li><li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes.">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li><li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus.">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li><li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep:+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence.">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li><li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions.">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li><li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity.">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li><li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture.">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li><li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein.">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li><li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus.">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li><li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype.">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li><li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus:+analysis+of+virus+production+and+infectivity.">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li></ol>

La GFP exprimer clone moléculaire de MVV présentés ici devraient être utiles pour analyser les interactions de la cellule hôte et la pathogénicité du MVV fois in vitro et in vivo. Le virus obtenu après 7-14 jours de la réplication a incontestablement acquis une certaine mutations dues à l&#39;imprécision de la transcriptase inverse. Cependant, il ya des limites à l&#39;utilisation de ce clone comme un vecteur seul cycle. La première est que l&#39;utilisation du clone est restreinte aux cellules de moutons e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein

Maedi-visna (MVV) est un lentivirus de moutons, provoquant lentement progressive pneumonie interstitielle et d&#39;encéphalite 1. Les cellules cibles primaires du MVV in vivo sont considérés comme des 2 lignée des monocytes. Certaines souches de MVV peuvent se reproduire dans d&#39;autres types cellulaires, toutefois 3,4. La protéine fluorescente verte est un marqueur couramment utilisé pour étudier les lentivirus dans des cellules vivantes. Nous avons inséré le gène EGFP dans le gène codant pour dUTPase du MVV. Le gène dUTPase est bien conservée dans la plupart des souches de lentivirus des ovins et caprins et a été montré pour être important dans la réplication du CAEV 5. Toutefois, dUTPase a été montré pour être dispensable pour la réplication du clone moléculaire de MVV utilisées dans cette étude in vitro et in vivo 6. Réplication MVV est strictement limitée aux cellules de mouton ou de chèvre d&#39;origine. Nous utilisons une lignée de cellules primaires de la choroïde de mouton du plexus (cellules SCP) pour la transfection et la propagation du virus 7. La MVV fluorescente est entièrement infectieuses et expression de l&#39;EGFP est stable pendant au moins six passages 8. Il ya une bonne corrélation entre les mesures de DICT 50 et EGFP. Ce virus devrait donc être utile pour la détection rapide des cellules infectées dans les études du tropisme cellulaire et la pathogénicité in vitro et in vivo 8.

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Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Nous décrivons un clone moléculaire du maedi-visna qui exprime la GFP et est entièrement infectieuses. La réplication de ce virus peut être détecté en utilisant la microscopie par fluorescence et la cytométrie de flux.

Détection de multiplication et un clone moléculaire infectieux du virus Maedi-visna qui exprime Green Fluorescent Protein

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