Name: propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von der isländischen Research Fund und der Universität von Island Research Fund gefördert.

1. Transfektion Die molekulare Klon ist in zwei Plasmiden, p8XSp5-EGFP und p67r, von 12 kb und 4,5 kb bzw. enthalten. 9,10 <ol><li> Cut äquimolaren Mengen der beiden Plasmide, dh 4,4 pg p8XSp5-eGFP und 1,6 ug p67r mit XbaI und ligieren vor der Transfektion. </li><li> Für die Ligation, verwenden Sie 1 Weiss Einheit Ligase in einem 50 ul Reaktions-und Inkubieren bei 16 ° C über Nacht. </li><li> Wenn Ligation abgeschlossen ist, inkubieren Ligationsmix bei 65 ° C für 15 min zu...

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	<li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna,+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep.">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li><li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes.">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li><li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus.">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li><li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep:+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence.">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li><li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions.">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li><li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity.">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li><li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture.">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li><li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein.">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li><li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus.">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li><li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype.">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li><li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus:+analysis+of+virus+production+and+infectivity.">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li></ol>

Die GFP-exprimierenden molekularen Klon des MVV hier vorgestellten sollte für die Analyse der Host-Zell-Interaktionen und Pathogenität von MVV sowohl in vitro und in vivo. Das Virus nach 7-14 Tagen der Replikation erhalten hat zweifellos einige Mutationen aufgrund der Ungenauigkeit der reversen Transkriptase erworben. Allerdings gibt es Einschränkungen bei der Verwendung dieser Klon als Single-Cycle-Vektor. Einer ist, dass die Verwendung der Klon-Zellen von Schafen und Ziegen Herkunft beschränkt ist. Die Transfektio...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein

Maedi-Visna Virus (MVV) ist ein Lentivirus von Schafen, was langsam fortschreitende interstitielle Pneumonie und Enzephalitis 1. Die primären Zielzellen von MVV in vivo gelten als der Monozyten-Linie 2 sein. Bestimmte Stämme von MVV können in andere Zelltypen zu replizieren, jedoch 3,4. Das grün fluoreszierende Protein ist ein häufig verwendeter Marker für die Untersuchung Lentiviren in lebenden Zellen. Wir haben die EGFP-Gen in das Gen für dUTPase der MVV eingefügt. Die dUTPase Gen ist in den meisten Lentivirus Stämme von Schafen und Ziegen erhalten und hat sich gezeigt, dass bei der Replikation von CAEV 5 wichtige. Allerdings hat dUTPase konnte gezeigt werden, entbehrlich für die Replikation des molekularen Klon des MVV in dieser Studie sowohl in vitro und in vivo 6 verwendet. MVV-Replikation ist streng auf Zellen von Schafen oder Ziegen Herkunft beschränkt. Wir verwenden eine primäre Zelllinie, die aus dem Plexus von Schafen (SCP-Zellen) für die Transfektion und Vermehrung der Virus 7. Die fluoreszierenden MVV ist voll Infektions-und EGFP-Expression über mindestens 6 Durchgänge 8 stabil. Es ist eine gute Korrelation zwischen den Messungen der TCID 50 und EGFP. Dieses Virus ist daher sinnvoll sein, für die schnelle Erkennung von infizierten Zellen in Studien Zelltropismus und Pathogenität in vitro und in vivo 8.

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Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Wir beschreiben einen molekularen Klon des Maedi-Visna Virus, das GFP exprimiert und ist voll ansteckend. Die Replikation von diesem Virus kann durch die Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen werden.

Propagierung und Erkennen einer ansteckenden Molecular Clone von Maedi-Visna Virus, das Green Fluorescent Protein exprimiert

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...