Name: propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av den isländska Research Fund och Islands universitet Research Fund.

1. Transfektion Den molekylära klonen finns i två plasmider, p8XSp5-EGFP och p67r, av 12 kb och 4,5 kb respektive. 9,10 <ol><li> Skär ekvimolära mängder av de två plasmiderna, dvs 4,4 pg av p8XSp5-EGFP och 1,6 pg p67r med Xbal och ligera före transfektion. </li><li> För ligering, använd 1 Weiss-enhet av ligas i en 50 | il reaktion och inkubera vid 16 ° C över natten. </li><li> När ligering är klar, inkubera ligeringsblandningen vid 65 ° C under 15 minuter för inak...

<ol>
	<li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna,+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep.">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li><li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes.">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li><li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus.">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li><li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep:+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence.">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li><li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions.">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li><li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity.">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li><li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture.">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li><li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein.">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li><li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus.">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li><li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype.">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li><li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus:+analysis+of+virus+production+and+infectivity.">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li></ol>

GFP uttryckande molekylära klon av MVV presenteras här bör vara användbart för att analysera värd-cell-interaktioner och patogenicitet av MVV både in vitro och in vivo. Viruset erhålls efter 7-14 dagars replikering har utan tvekan fått en del mutationer på grund av oriktiga omvänt transkriptas. Men det finns begränsningar för användningen av denna klon som en enda cykel vektor. En är att användningen av klonen är begränsad till celler av får och get ursprung. Transfektionseffektiviteten av dessa celle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein

Maedi-visna-virus (MVV) är ett lentivirus av får, vilket långsamt progressiv interstitiell pneumoni och encefalit 1. De primära målceller av MVV in vivo anses vara av monocyt härstamning 2. Vissa stammar av MVV kan replikera i andra celltyper, emellertid 3,4. Den gröna fluorescerande proteinet är ett vanligt använt markör för att studera lentivirus i levande celler. Vi har satt in EGFP genen i genen för dUTPas av MVV. Den dUTPas genen är väl bevarad i de flesta lentivirus stammar av får och getter och har visat sig vara viktiga för replikering av CAEV 5. Emellertid har dUTPas visats vara umbärliga för replikering av den molekylära klonen av MVV används i denna studie både in vitro och in vivo 6. MVV replikering är strikt begränsad till celler av får eller get ursprung. Vi använder en primär cell-linje från koroid plexus hos får (SCP-celler) för transfektion och förökning av viruset 7 &lt;/ Sup&gt;. De fluorescerande MVV är helt smittsam och EGFP uttryck är stabil under minst 6 passager 8. Det finns god korrelation mellan mätningar av TCID 50 och EGFP. Detta virus bör därför vara användbara för snabb detektion av infekterade celler i studier av cell tropism och patogenicitet in vitro och in vivo 8.

Watch this Scientific Journal Video about Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Vi beskriver en molekylär klon av maedi-visna-virus som uttrycker GFP och är helt smittsam. Replikering av detta virus kan detekteras genom användning av fluorescensmikroskopi och flödescytometri.

Föröknings-och Upptäcka en smittsam molekylär klon av Maedi-visna virus som uttrycker grönt fluorescerande protein

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Särskild märkning av HIV-1 positiva celler med hjälp av en Rev-beroende Lentiviral Vector uttrycka det grönt fluorescerande proteinet

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Levande cell imaging av Alphaherpes Virus Anterograd Transport och Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellering livscykel Ebola Virus Under skyddsnivå 2 Villkor Med virusliknande partiklar innehållande Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious cellodlingssystem och<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktiska effekten av interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseumbindningsanalys som förutspår läkemedelspenetration i tuberkulos-lesioner

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...