Name: annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics
Uploaded: 2012-06-17T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics at JoVE.com

Vi takker Prof. Kazuki Saito i Riken PSC og Dr. Bjørn Usadel i MPIMP for nyttige drøftelser. TT understøttes af et fællesskab fra Alexander von Humboldt fundament.

1. Prøvefremstilling <ol><li> Plantematerialer høstes og straks nedfrosset. </li><li> Frosne plantematerialer er pulverformige af blanderen mølle (eller mørtel) og lagres i Falcon-rør eller Eppendorf-rør ved -80 ° C. </li></ol> 2. Ekstraktion for metabolit Profiling <ol><li> Portion frosset plantemateriale i en 2 ml Eppendorf-rør. </li><li> Tilsættes 5 ul ekstraktionsbuffer milligram af frisk vægt af frosset plantemateriale. </li><li> Tilsættes et metal (eller gilconia) kuglen og homogeniseres frosne pulver med blanderen Mill i 2 minutter ved 25 ls-1. </li><li> Centrifugeres 10 minutter ved 12.000 rpm. </li><li> Supernatanten overføres til NANOSEP centrifugalfilterenhed. </li><li> Centrifuger i 2 minutter ved 4000 rpm. </li><li> Supernatanten overføres til nyt Eppendorf-rør og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse. </li></ol> 3. Metabolit Profilering ved LC-MS <ol><li> Nedsat HPLC og kontrollere temperaturen af ​​søjlen ovnen og prøvebakken. </li><li> Opsæt MS tilstand og kontrollere dennes aktuelle status af vakuum og varme kapillær. </li><li> Udfør m / z kalibrering af MS-detektor. </li><li> Overførsel af 50 ul ekstrakt til hætteglas til LC-MS. </li><li> Indsprøjtes 5 ul af ekstrakter til LC-MS. </li></ol> 4. Dataanalyse <ol><li> Konfigurer Xcalibur eller Metalign 4, og vælg den dataanalyse, der skal behandles. </li><li> Forbered en tabel over fundne toppe af din interesse i overensstemmelse med sammensatte klasse i tabel I. </li><li> Identificer toppe ved co-eluering af standard forbindelser. </li><li> Anmærk opdaget toppe bruger MS 2 analyse, litteraturoversigt, metabolit databasesøgning (figur 2, 12,13). </li></ol> 5. Forudsigelse af metabolismepathway&#39;en <ol><li> Konstruer en mulig vej med fundne forbindelser. Forudsigelse af vejen ved hjælp af peak annotationer bør være baseret på den kemiske struktur af detekterede stofs ved at forudsige forbinder enzymatiske funktioner på metaboliseringsvej 13. Strukturering biosyntetiske trin bør gennemføres med præcis peak annotation. Men bestemmelse af nøjagtig kemisk struktur, f.eks sukkerdelen er ikke uundværlige i dette trin, fordi forudsigelse af sukkerdelen og adducerede position er meget vanskeligt at identificere med MS-analyse. Bestemmelse af sukker-type som hexoside og pentoside vil blive identificeret ved enzymatisk analyse af sukker donor på det sidste trin af projektet. Meste konstruere forudsigelse af pathway bør udføres så lille molekyle er mellemprodukt med større molekyle med undtagelse af de visse tilfælde, såsom dehydratiseringsreaktion. Listen af atomart molekylvægt, for eksempel 16 m / z for forskel-H og-OH-del (oxidation), 14 m / z (carbonatom) for forskellen mellem-OH og-OMe (methylering) og 162 m / z ( MW-H2O) for hexose (glycosylering), er nyttig til forudsigelse. Bestemmelse afændring type med korrelationsanalysen af ​​væv specificiteter hjælper forudsigelse af metaboliseringsvej. Database over generelle metaboliseringsvejen såsom KEGG database ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) og PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), er meget effektiv til forudsigelse af metaboliseringsvej for din interesse. </li></ol> 6. Fremstillinq af Gene liste med Arabidopsis ortologe Gene ID <ol><li> Hent gen ID-listen fra genomisk database. </li><li> Tilføj Arabidopsis gen ID ortologe gen, i tilfælde af dit mål anlæg er ikke Arabidopsis. </li><li> Forbered en liste over gener i jeres vej-af-interesse. Annotation af Arabidopsis pathway data og genfamiliemedlemmer data er tilgængelige i tair hjemmeside ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Hvis du udarbejdet en liste over Arabidopsis ortologe gener, kan du efterfølgende kombinationne dem. </li></ol> 7. Co-udtrykt gen analyse <ol><li> Test det klargjorte genet ID-liste for at søge den bedste database til din vej ved at kontrollere sammenhængen med kendte genpar i din vej-af-interesse (Tabel II). Hvis co-ekspression database eller genekspression databasen ikke er tilgængelige i anlæg din interesse, skal Arabidopsis co-ekspression database bruges sammen med en liste over Arabidopsis ortologe gener. I tilfælde af byg, ris, poppel, hvede, Medicago og sojabønne, co-ekspression analyse af plantearter anvendes (tabel II). </li><li> Konstruer rammerne for din målgruppe co-ekspression netværk baseret på forbindelserne af de kendte gener i jeres vej-af-interesse. </li><li> Tilføj korrelerede kandidatgener (r &lt;0,4 ~ 0,90, inden tilnærmet værdi af koefficienten værdi mellem forbindelserne af de kendte gener i jeres vej-af-interesse) og kontrollere deres gen anmærkning i din PRedicted familier til tilslutninger af dette netværk for at finde de bedste kandidatgener (figur 3). Threshold af koefficient værdi bør koordineres i overensstemmelse med nettets struktur og tæthed af korrelerede gener. </li><li> Lav liste over de gener, som du er i stand til at indsnævre som værende specialiseret til dit mål vej. </li><li> Check genekspression af orgel særlige forhold og stress reaktioner af dine kandidatgener. </li></ol> 8. Integration af alle information til at forudsige nye veje <ol><li> Tilsættes velkarakteriserede gener, der er anvendt til søgning af co-ekspression analyse forudsagde metabolisk pathway. </li><li> Se ukarakteriserede dele i denne vej, for eksempel ukarakteriseret enzymatiske trin, transport proteiner og transkriptionsfaktorer. </li><li> Forudsige mest egnet gen anmærkning af disse manglende ukarakteriserede trin. </li><li> Kombiner resultater af metabolit profilering og kandidatgener af in silico gene ekspression baseret på den forudsagte bane. </li><li> Arrangere kandidatgener for den forudsagte pathway ifølge genfunktion, for eksempel acetyltransferase for acetylerede metabolit, glycosyltransferase for glycosid, P450 for oxideret forbindelse. Fylogenetisk træ analyse af aminosyresekvenserne er nyttigt til nogle brede genfamilien såsom P450 og glycosyltransferase. </li><li> Kontroller konsekvens af vævs-forhold eller stress reaktioner mellem metabolit ophobning og genekspression niveau af kandidatgener. </li><li> Kontrollér forbindelserne til andre stofskifte for at give substrat og stress responsive gener. </li></ol> 9. Eksperimenter til Gene identifikation ved hjælp af Bio-ressourcer <ol><li> Kontroller tilgængeligheden af ​​bioressourcer for lettelse af eksperiment for kandidat gen identifikation. </li><li> Udfør et eksperiment for identifikation af gen-funktion ved hjælp af bio-ressourcer, såsom KO mutantbibliotek og fuld-længde cDNA bibliotek. Than eksperimenter til funktionel identifikation af gener med fremstilling af overekspression planter og knockout mutanter enzymatisk assay og promotoren bindingsassay skal udføres for de bedste kandidatgener i din forudsigelse. Rekombinant protein assay for karakterisering af protein egenskaber og fremstilling af overekspression planter bedre skal udføres efter bekræftelse af metabolit profil med KO-mutant, da det tager betydeligt længere tid at fremstille rekombinant protein, og genkloning til transformation. </li></ol> 10. Repræsentative resultater Proceduren for integreret analyse er beskrevet i denne protokol har mange muligheder afhængig angivne eksperimenterende formål og valg af biologiske og analytiske kombinationer. Valg af procedurer og eksperimentel design bør udføres korrekt på grundlag af dit mål vej, forbindelser og plantearter. Integrationsstrategien er beskrevet i denne protokol er FOC<html> bruges på annotation af plante genfunktion og opdagelsen af ​​nye gen funktioner med en effektiv udnyttelse af flere bio-og data-ressource. Forventet udfald er lovet at give med det eneste tilfælde af afgørende forudsigelse. Dette faktum indikerer, at hvis der er nok beviser ikke kan gives ved kombination profiler, bør eksperimentere ikke startes. Af denne grund, i alle tilfælde kan yderligere indledende eksperimenter såsom målrettet genekspressionsprofilering ved RT-PCR, understøtter din forudsigelse af gen-funktion. Nøjagtigheden og korrektheden af ​​forudsigelser korrelerer højere afhængig af kvalitativ forskel og antallet af variation af kombination. Desuden kan gode kandidater og gyldige resultater kun komme fra præcis forudsigelse af veje. Peak annotation bør gennemføres af en kombination af flere forskellige måder, for eksempel litteratur-undersøgelse, der henvises planteekstrakt, MS n analyse, orgel specificitet og mutant analyse 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Oversigt over den eksperimentelle strømmen af genet kommentar via kombinerede metode. I nogle tilfælde, starte projekter med opdagelsen af et nyt højdepunkt, der påvises hos særlige betingelser eller væv, og ønsket om at forstå sin rolle inden for sit stofskifte. I andre tilfælde formål projektet er genidentifikation eller opdagelsen af ​​vigtige regulatoriske faktorer såsom transkriptionsfaktorer. Udformningen af ​​forsøget bør høvlet med en datasæt, der viser tydelige forskelle af metabolit niveauer i target pathway ved anvendelse af en bred vifte af vævsprøver fra forskellige organer, og for differentielt dyrkede planter eller planter udsat for stress-tilstande, og at udsætte materialet for metabolit profilering. Mutante og transgene planter såvel som QTL husning avl materiale udgør også egnet genetisk materiale til disse undersøgelser. Forudsigelse af nye vej skal udføres omhyggeligt med nøjagtigpeak annotation og kombination tilgang med forskellige typer metabolotype såsom orgel værdipapirer og stress reaktioner i henhold til genekspression data på din vej-af-interesse. I det sidste trin, bør metabolit og transkript profilering udføres som i sidste ende vil, når de kombineres med in silico analyse af web-midler og in vitro karakterisering af genekspression via heterolog ekspression fører til bekræftelse af genet kandidaten og belysning af dens funktion og position i et metabolisk pathway. Forkortelser: QTL og kvantitativ egenskab loci. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Figur 2. Arbejde strøm af kombinatorisk fremgangsmåde til top noter. En procedure til top identifikation og noter af standarden forbindelsen, sammenlignet med vildtype-og slå mutanter, multi-dimensional massespektrometri af målet top henvisning til massespektre ren compounds fra databaser 12. Forkortelser: DB, database, KO, knock-out, 1-D, en-dimensionelle, 2-D, to-dimensionelle NMR, kernemagnetisk resonans, IR, infrarød, MS n, masse-masse spectrometries. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Figur 3. Eksempel samregulering netværk analyse af anthocyanin-vejen. Coekspression analyser blev udført ved anvendelse af Prime ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) baseret på datasættet ATTEDII version 3 8,2 med Pajek program ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Positive korrelationer (r &lt;0,5) anvendes til at netværksforbindelser. Rød node: tolv anthocyanin enzymatiske gener (At5g13930 og CHS, TT4 og chalcon-synthase, At3g55120, CHI, TT5, chalcon isomerisere, At3g51240, F3H, TT6, flavanon-3-hydroxylase, At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonoid-3&#39;-hydroxylase, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoid-3 - O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reduktase, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin Synthese, At4g14090, A5GT, anthocyanin 5 - O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 &quot;XT, formodede anthocyanin 3 - O-glucosid 2&quot; - O - xylosyltransferasen, At3g29590, A5GMaT, anthocyanin 5 - O-glucosid 6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyanin 3 - O-glucosid 6 &quot;- O - P-coumaroyltransferase) og to transkriptionsfaktorer til anthocyanin produktion (At1g56650, PAP1, At1g66390, PAP2) blev anvendt til at søge kandidatgener kandidatgener blev fundet af en &quot;skæringspunktet mellem sæt&quot; søgning med en tærskelværdi med en koefficient på r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 spørgsmålstegn ved skæringspunktet mellem sæt af alle forespurgte gener (fjorten anthocyanin biosyntesegener). En co-ekspression netværk, herunder korrelerede kandidatgener (68 gener) og spurgte gener (14 gener), blev re-konstrueret af en &quot;sammenkobling af sæt&quot; Søg med r&gt; 0,50 ved hjælp af PRIME-databasen. De output filer, der blev formateret med en &#39;. Net&#39; fil fra PRIME databasen og netværk blev udarbejdet ved hjælp af Pajek software. Blå knudepunkt angiver kandidatgener som korrelerede med anthocyanin gener. <table border="1"><tbody><tr><td> arter </td><td> Major sekundær metabolit </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolater, flavonol, anthocyanin, sinapoyl afledte </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonol, anthocyanin, salicylat derivat </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonol, anthocyanin, tannin, stilbene </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonol, anthocyanin, glycoalkaloid, chrologenate relaterede, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonol, anthocyanin, nicotianamide, chrologenate relaterede, acylsugar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, anthocyanin, sterolderivater </td></tr><tr><td> Zea maj </td><td> Glycoflavone, anthocyanin, benzoxazinon, sterolderivater </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavon, anthocyanin, saponin, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavon, flavonol, anthocyanin, saponin, </td></tr></tbody></table> Tabel I. Større sekundære metabolitter i model plantearter. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-udtryk database </td><td> Adresse </td></tr><tr><td> Plant kryds specerne </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Plantearter </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Rice Array Database </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabel II. Fås genekspression database for in silico co-ekspression analyse.

<ol>
	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria.">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li><li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li><li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis.">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li><li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlaNet:+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species.">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li><li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis.">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li><li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATTED-II:+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis.">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li><li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoP:+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants.">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li><li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets.">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li><li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana:+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes.">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics:+A+user's+guide.">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genetic+diversity,+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function.">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li><li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation.">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, (2011).</li><li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Da transcriptomics og metabolomik teknologi er blevet brugt i flere år, processen med dataintegration til metabolomics bistået gen annotation generelt begynder med identifikation af en ny spids, der repræsenterer en ukendt metabolit. Dette faktum fører til den næste fase, som er at vurdere kvantitativ varians i metabolit toppe eller de nye kandidatgener menes at være ansvarlige for deres biosyntese. Strategien er beskrevet i denne protokol, dog har tre store problemer i) vanskelig spids kommentar, ii), kompleksitet af sti forudsigelse, iii) opløsning af gen information og kvaliteten af ​​genekspression data. For at imødegå det første problem, bør peak noter udføres med co-eluering af standard forbindelser eller kombinatorisk tilgang udnytte informationer fra MS n analyse, referenceekstrakt, mutant analyse, metabolit database søgning og litteraturoversigt (figur 2, 12). For second problem, kan sti forudsigelse kun opnås ved korrekt peak annotation. Men metabolit profilering af vævsspecificitet kan også være støtte peak noter, fordi metabolitten akkumulation skal korreleret med genekspressioner af beslægtede gener. Derfor kombination profiler i forskellige væv og vækstbetingelser kan være nyttigt for dette andet problem. Det tredje problem vedrørende løsning af genet oplysninger afhænger af forløbet af sekvens data. I tilfælde af modellen plante uden afslutning genomsekvens, er co-ekspression analyse under anvendelse ortologe gener i andre modeller planter nyttig. Detaljeret tilpasning sammenligning og fylogenetisk træ analyse af aminosyre-sekvensen kan understøtte at forbinde modelorganismer til andre arter. Denne forskrift er velegnet til alle metabolismer. Det er mest effektive i analysen af ​​mellemprodukter og sekundære stofskifte, som er velkarakteriserede at være genstand for stærk transkriptionel cONTROL 1,5,11,16. I nogle eksempler, co-ekspression analyse lykkedes at blive udført i svovl assimilation, gener for β-oxidation, forgrenet aminosyre nedbrydning, klorofyl nedbrydning, og lysin-katabolisme 3, cellevæg metabolisme 10,7 og lette signaleringskaskade 14. Annotation af genfunktion via kombinerede genomik og metabolomik og informatik er ikke kun for biosyntesegen og direkte regulator af transkriptionsfaktor, men også for at forstå fysiologisk proces og respons (se eksempel figur 3. 14). For at udvikle denne fremgangsmåde fra model planter til afgrødearter, metaboliske sammenligning af på tværs af plantearter er kraftig tilgang i nogle generelle stofskifte. Eksempelvis kan visse ortologe gener, hvis samme forbindelse påvises i forskellige plantearter, og findes i disse plantearter, kan på tværs af arter co-ekspression analyse under anvendelse ortologe gener tilvejebringe strong support til din forudsigelse. Denne fremgangsmåde kan udføres i Arabidopsis, poppel, Medicago, ud vigtige afgrøder, såsom byg, ris, hvede og sojabønne, ved co-ekspression analyse af plantearter (6, Planet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,, 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> , se et eksempel, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Destilleret vand ULC / MS Grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitril (ACN) ULC / MS klasse </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Methanol (MeOH) ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Myresyre (HCOOH) ULC / MS kvalitet til væskekromatografi </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Standardforbindelser </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Lineær ion trap (IT) ESI-MS-system Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC system Surveyor </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytisk søjle Luna C18 (2), 2,0 mm diameter, 150 mm længde, 100 Å porestørrelse og sfæriske partikler på 3 mm </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

I betragtning af det stadigt stigende antal model plantearter som komplette genom sekvenser, der er til rådighed, og den overflod af bio-ressourcer såsom knockout mutanter, vilde tiltrædelser og avancerede ynglebestande, er der en stigende byrde for gen funktionel annotation. I denne protokol, kommentering af anlæg genfunktion ved kombineret co-ekspression gen analyse er metabolomics og informatik forudsat (figur 1). Denne fremgangsmåde er baseret på teorien om anvendelse target gener med kendt funktion at muliggøre identifikation af ikke-kommenterede gener antages at være involveret i en bestemt metabolisk proces med identifikationen af ​​målforbindelser via metabolomics. Strategier er fremsat for at anvende disse oplysninger på befolkningen genereret af både fremadkørsel og omvendt genetik tilgange på trods af ingen af ​​disse er ubesværet. Ved konsekvens denne fremgangsmåde kan også anvendes som en fremgangsmåde til at karakterisere ukendte toppe repræsenterer nye eller specifikke sesekundært metabolitter i de begrænsede væv plantearter eller stress behandling, som i øjeblikket er den vigtige forsøg for at forstå planternes stofskifte.

Watch this Scientific Journal Video about Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics at JoVE.com

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Kombination af genomforskning, co-ekspression gen analyse og identifikation af målforbindelser via stofskifte giver gen funktionelle annotation.

Annotation af Plant genfunktion via Kombinerede Genomics, metabolomik og Informatik

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Kombineret Immunofluorescens og DNA FISH på 3D-bevaret Interfasen Kerner til Uddannelse Ændringer i 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisere Stromule Frekvens med Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Split grøn fluorescerende proteiner System til at visualisere effektorer leveret fra bakterier under infektion

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

High-Throughput Live Imaging af mikrokolonier til måling af heterogenitet i vækst og genekspression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

mirMachine: En one-stop-shop for plante miRNA-annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Bestemmelse af trepartsinteraktion mellem to monomerer af en MADS-box transskriptionsfaktor og et calciumsensorprotein ved BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...