Name: annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics
Uploaded: 2012-06-17T14:00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics at JoVE.com

Vi takker professor Kazuki Saito i Riken PSC og Dr. Bjørn Usadel i MPIMP for nyttige diskusjoner. TT er støttet av et fellesskap fra Alexander von Humboldt fundament.

1. Prøvepreparering <ol><li> Plantemateriale høstes og fryses umiddelbart. </li><li> Frosne plantematerialer blir pulverisert av mikser mill (eller morter) og lagres i Falcon tube eller Eppendorf rør ved -80 ° C. </li></ol> 2. Utvinning for metabolitt Profiling <ol><li> Delmengde frosset plantemateriale i en 2 ml Eppendorf rør. </li><li> Tilsett 5 mL av utvinning buffer per milligram av ferskvekt av frossen plantemateriale. </li><li> Legg en metall (eller gilconia) ball og homogenisere av frossen pulver med Mixer Mill for 2 min ved 25 ls -1. </li><li> Sentrifuger 10 min ved 12 000 rpm. </li><li> Overfør supernatanten til NANOSEP sentrifugalfilter. </li><li> Sentrifuger 2 min ved 4000 rpm. </li><li> Overfør supernatanten til nytt Eppendorf rør, og oppbevar ved -20 ° C inntil bruk. </li></ol> 3. Metabolitt Profilering av LC-MS <ol><li> Sett opp HPLC og sjekke temperaturen på kolonnen ovnen og prøve skuff. </li><li> Sett opp MS tilstand og sjekke tilstanden til vakuum og varme kapillært. </li><li> Utfør m / z kalibrering av MS detektor. </li><li> Overføring av 50 mL av ekstrakter til hetteglass for LC-MS. </li><li> Injiser 5 mL av ekstrakter til LC-MS. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Konfigurer Xcalibur eller Metalign 4 og velg dataanalyse for å bli behandlet. </li><li> Utarbeide en tabell over oppdagede topper er interessert i samsvar med sammensatte klasse i tabell jeg. </li><li> Identifiser topper med co-eluering av standard forbindelser. </li><li> Annotate oppdaget topper med MS 2 analyse, litteraturstudium, metabolitt database søk (figur 2, 12,13). </li></ol> 5. Prediksjon av metabolismevei <ol><li> Konstruer en mulig vei med påvist forbindelser. Prediksjon av veien ved hjelp av peak merknadene bør baseres på den kjemiske strukturen oppdaget sammensattes ved å forutsi knytte enzymatiske funksjoner på metabolismevei 13. Strukturering biosyntetiske trinn skal utføres med presis topp merknad. Men fastsettelse av detaljerte kjemiske struktur, for eksempel sukker moiety, er ikke uunnværlig i dette trinnet, fordi prediksjon av sukker moiety og adduserte posisjon er svært vanskelig å identifisere ved MS analyse. Bestemmelse av sukker typen som hexoside og pentoside vil bli identifisert ved enzymatisk analysen av sukker donor i siste trinn av prosjektet. Stort sett bygging av prediksjon av veien bør utføres som lite molekyl er mellomprodukt i større molekyl unntatt i noen tilfeller som dehydrering reaksjon. Liste over atom-molekylvekt, for eksempel 16 m / z for forskjellen mellom-H og-OH moiety (oksidasjon), 14 m / z (karbonatom) for forskjell mellom-OH og-OMe (metylering) og 162 m / z ( MW-H 2 O) for hexose (glykosylering), er nyttig for prediksjon. Bestemmelse avmodifikasjon type med korrelasjon analyse av vev spesifisiteter hjelper prediksjon av metabolismevei. Database av generell metabolismevei som KEGG database ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) og PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), er svært effektiv for prediksjon av metabolismevei av interesse. </li></ol> 6. Utarbeidelse av Gene Liste med Arabidopsis Orthologous Gene ID <ol><li> Last ned genet ID liste fra genomisk database. </li><li> Legg Arabidopsis genet ID orthologous genet, i tilfelle målet anlegget er ikke Arabidopsis. </li><li> Utarbeide en liste av gener i din sti-of-interesse. Annotering av Arabidopsis spredningsveier data og gen familie data er tilgjengelige i Tair nettsted ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Hvis du utarbeidet en liste over Arabidopsis orthologous gener, kan du senere combine dem. </li></ol> 7. Co-uttrykte Gene Analysis <ol><li> Test bruke forberedt genet ID-listen for å søke best mulig database for vei din ved å sjekke korrelasjonen med kjente genet parene i din vei-of-interesse (tabell II). Hvis co-uttrykket database eller genekspresjon database ikke er tilgjengelig i anlegget av interesse, bør Arabidopsis co-uttrykk database brukes med en liste over Arabidopsis orthologous gener. I tilfelle av bygg, kan ris, poppel, hvete, Medicago og soyabønner, co-uttrykk analyse av plantearter brukes (tabell II). </li><li> Konstruer rammene for din målgruppe co-uttrykk nettverk basert på tilkoblingene av de kjente gener i din sti-of-interesse. </li><li> Legg korrelerte kandidat gener (r &lt;0,4 ~ 0,90, innenfor omtrentlig verdi på koeffisienten verdi mellom tilkoblinger av de kjente gener i din sti-of-interesse) og sjekke deres genet merknaden i din predicted familiene til tilkoblinger av dette nettverket for å finne beste kandidat gener (figur 3). Terskel av koeffisientverdien bør koordineres i henhold til nettverk struktur og tetthet av korrelerte gener. </li><li> Lag liste av gener som du er i stand til å innskrenke som spesialiserte til din målgruppe veien. </li><li> Sjekk genuttrykk av orgelet spesifisiteter og stressresponser av din kandidat gener. </li></ol> 8. Integrasjon av all informasjon å forutsi nye Pathways <ol><li> Legg godt karakterisert gener som har blitt brukt for spørring av co-uttrykk analyse til spådd metabolismevei. </li><li> Sjekk uncharacterized deler i denne veien, for eksempel uncharacterized enzymatiske trinn, transport proteiner og transkripsjonsfaktorer. </li><li> Forutsi mest egnet genet merknader for disse manglende uncharacterized trinnene. </li><li> Kombiner resultatene av metabolitten profilering og kandidat gener av i silico gene uttrykk basert på spådd veien. </li><li> Ordne kandidat gener på spådd veien i henhold til gen-funksjon, for eksempel, acetyltransferase for acetylert metabolitt, glycosyltransferase for glycoside, P450 for oksiderte sammensatte. Fylogenetisk tre analyse av aminosyre sekvenser er nyttig for noen bred genet familie som P450 og glycosyltransferase. </li><li> Sjekk konsistensen av vev spesifisiteter eller stressresponser mellom metabolitt akkumulering og genuttrykk nivå av kandidat gener. </li><li> Kontroller forbindelsene til andre stoffskifte for å gi underlaget og stress responsive gener. </li></ol> 9. Eksperimenter for Gene identifisering ved hjelp av Bio-ressurser <ol><li> Kontroller tilgjengeligheten av bioressurser for tilrettelegging av eksperiment for kandidat genet identifikasjon. </li><li> Utføre et eksperiment for identifisering av gen-funksjon ved hjelp av bio-ressurser, for eksempel KO mutant bibliotek og full-lengde cDNA bibliotek. THan eksperimenterer for funksjonell identifisering av gener med utarbeidelse av overuttrykk planter og knockout mutanter, enzymatisk analyse og promoter bindende analysen skal utføres for den beste kandidaten gener i prediksjon din. Rekombinant protein assay for karakterisering av protein eiendommer og utarbeidelse av overuttrykk planter bedre skal utføres etter bekreftelse av metabolitt profil ved hjelp av KO mutant siden det tar betydelig lengre tid å forberede rekombinant protein og gen kloning for transformasjon. </li></ol> 10. Representative Resultater Prosedyren for integrert analyse som beskrevet i denne protokollen har mange muligheter, avhengig av spesifiserte eksperimentelle formål og valg av biologiske og analytiske kombinasjoner. Valg av prosedyrer og eksperimentell design bør utføres riktig på bakgrunn av målet vei, forbindelser og plantearter. Integrasjonen Strategien er beskrevet i denne protokollen er foc<html> brukt på annotering av anlegget gen-funksjon og oppdagelsen av nye genet funksjoner med en effektiv bruk av flere bio-og data-ressurs. Forventet resultat er lovet å gi med det eneste tilfellet av avgjørende prediksjon. Dette faktum viser at hvis mange nok bevis ikke kan gis av kombinasjonen profiler, bør eksperimentere ikke startes. Av denne grunn, i noen tilfeller kan flere gangsetting eksempel målrettet gene expression profilering av RT-PCR, støtte din prediksjon av gen-funksjon. Nøyaktighet og riktigheten av prediksjon korrelerer høyere, avhengig av kvalitativ forskjell og antall variasjon av kombinasjonen. I tillegg kan gode kandidater og gyldige resultater bare kommer fra nøyaktig prediksjon av stier. Peak merknad bør gjennomføres ved kombinasjon av flere tilnærminger, for eksempel litteraturstudium, referanse plante ekstrakt, MS n analyse, orgel spesifisitet og mutant analyse 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Oversikt over den eksperimentelle flyten av genet annotasjon via kombinert tilnærming. I noen tilfeller prosjektene starter med oppdagelsen av en roman topp som er oppdaget i spesielle forhold eller vev, og ønsket om å forstå sin rolle i metabolismen. I andre tilfeller formålet med prosjektet er genet identifikasjon eller oppdagelse av viktige regulatoriske faktorer som transkripsjonsfaktorer. Design av eksperiment bør høvlet med en datasettet som viser klare forskjeller på metabolitter i din målgruppe veien, ved hjelp av et bredt spekter av vevsprøver fra ulike organer, og for ulikt dyrket planter eller planter som er utsatt for stress forhold, og utsette materialet for å metabolitten profilering. Mutant og transgene planter samt QTL husing avlsmateriale også representere egnet genetisk materiale for disse studiene. Prediksjon av romanen vei bør utføres nøye med nøyaktigtopp merknader og kombinasjon tilnærming med annen type metabolotype som orgel verdipapirer og stressresponser i henhold til genuttrykk dataene på en sti-of-interesse. I det siste trinnet, bør metabolitt og karakterutskrift profilering utføres som til slutt vil, når den kombineres med i silico analyse av web-ressurser og in vitro karakterisering av genekspresjon via heterologe uttrykk, føre til bekreftelse av genet kandidat og belysning av dens funksjon og posisjon innenfor en metabolismevei. Forkortelser: QTL, kvantitative Trait Loci. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Figur 2. Arbeid flyt av kombinatoriske tilnærming for topp kommentering. En prosedyre for topp identifisering og annotering av standard sammensatte, sammenligning av vill type og slå ut mutanter, multi-dimensjonale massespektrometri av målet topp henviser til masse spektra av ren compounds fra databasene 12. Forkortelser: DB, database, Ko, knock-out; 1-D, endimensjonale, 2-D, to-dimensjonale, NMR, nukleær magnetisk resonans, IR, infra-rød, MS n, masse-masse spectrometries. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Figur 3. Eksempel co-regulering nettverk analyse av Antocyanin veien. Coexpression Analysene ble utført ved hjelp av PRIME ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) basert på datasettet av ATTEDII versjon 3 8,2 med Pajek program ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Positive korrelasjoner (r &lt;0,5) brukes til å lage nettverkstilkoblinger. Red node: tolv mengde anthocyaniner enzymatiske gener (At5g13930 og luftmasker, TT4 og Chalcone syntase, At3g55120, CHI, TT5, Chalcone isomerise, At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-hydroksylase, At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonoid 3&#39;-hydroksylase, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, 3 flavonoid - O-glucosyltransferase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reduktase, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin synthese, At4g14090, A5GT, Antocyanin 5 - O-glucosyltransferase; At5g54060, A3G2 &quot;XT, utlagde Antocyanin 3 - O-glucoside 2&quot; - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, 5 Antocyanin - O-glucoside 6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, 3 Antocyanin - O-glucoside 6 &quot;- O - p-coumaroyltransferase) og to transkripsjonsfaktorer for Antocyanin produksjon (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) ble brukt for å søke kandidat gener kandidat gener ble funnet av en &quot;krysset av sett&quot; søk med en terskelverdi med en koeffisient på r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 spørres av krysset mellom settene av alle gener spørres (Fjorten mengde anthocyaniner biosyntetiske gener). En co-uttrykk nettverk, inkludert korrelerte kandidat gener (68 gener) og spørres gener (14 gener), var re-konstruert av en &quot;samtrafikk sett&quot; søk med r&gt; 0,50 ved hjelp av PRIME databasen. Utdatafiler som ble formatert med en &#39;. Net &quot;-filen fra Statsministerens databasen og nettverk ble tegnet med Pajek programvare. Blå node indikerer kandidat gener som korrelert med mengde anthocyaniner gener. <table border="1"><tbody><tr><td> arter </td><td> Major sekundær metabolitt </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolate, flavonol, Antocyanin, sinapoyl derivat </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonol, Antocyanin, salicylate derivat </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonol, Antocyanin, tannin, stilbene </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonol, Antocyanin, glycoalkaloid, chrologenate relatert, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonol, Antocyanin, nicotianamide, chrologenate relatert, acylsugar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, Antocyanin, sterol derivater </td></tr><tr><td> Zea kan </td><td> Glycoflavone, Antocyanin, benzoxazinone, sterol derivater </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavone, Antocyanin, saponin, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavone, flavonol, Antocyanin, saponin, </td></tr></tbody></table> Tabell I. Store sekundære metabolitter i modellen plantearter. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-uttrykk database </td><td> Adresse </td></tr><tr><td> Plant kryss species </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> Planet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Plantearter </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Rice Array Database </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabell II. Tilgjengelig genuttrykk database for i silico co-uttrykk analyse.

<ol>
	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria.">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li><li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li><li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis.">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li><li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlaNet:+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species.">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li><li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis.">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li><li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATTED-II:+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis.">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li><li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoP:+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants.">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li><li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets.">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li><li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana:+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes.">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics:+A+user's+guide.">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genetic+diversity,+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function.">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li><li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation.">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, (2011).</li><li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Gitt at transcriptomics og metabolomics teknologi har vært brukt i flere år, begynner prosessen med dataintegrasjon for metabolomics assistert genet merknad generelt med identifisering av en roman topp representerer en ukjent metabolitt. Dette faktum fører til neste trinn som er å vurdere kvantitativ variansen i metabolitt topper eller romanen kandidat gener antas å være ansvarlig for biosyntesen deres. Strategien er beskrevet i denne protokollen, men har tre store problemer jeg) vansker av peak annotasjon, ii) kompleksitet pathway forutsigelse, iii) oppløsning av genet informasjon og kvaliteten av genuttrykk data. For å motvirke den første problemet, bør topp kommentering utføres med co-eluering av standard forbindelser eller kombinatorisk tilnærming utnytte informasjon fra MS n analyse, referanse ekstrakt, mutant analyse, metabolitt database søk og litteratur undersøkelsen (figur 2, 12). For second problem, kan veien prediksjon bare oppnås ved riktig peak merknad. Men metabolitt profilering av vev spesifisitet kan også være støtte peak merknader, fordi metabolitten akkumulering bør være korrelert med de genekspresjon av gener. Derfor kombinasjon profiler av ulike vev og vekstforhold kan være nyttig for dette andre problemet. Den tredje problem om oppløsningen av genet informasjon avhenger av fremdriften i sekvens data. I tilfelle av modellen anlegget uten gjennomføring av genom sekvens, er co-uttrykk analyse ved hjelp orthologous gener i andre modellsystemer planter nyttig. Detaljert justering sammenligning og fylogenetisk tre analyse av aminosyresekvens kan støtte for å koble modellorganismer til andre arter. Denne protokollen er egnet for alle metabolisms. Det er mest effektivt i analysen av innsatsvarer og videregående metabolisms som er godt karakterisert til å være gjenstand for sterk transcriptional control 1,5,11,16. I noen eksempler, co-uttrykk analyse lyktes å bli utført i svovel assimilasjon, gener for β-oksidasjon, forgrenet-chain amino syre degradering, klorofyll sammenbrudd, og lysin katabolisme 3, cellevegg metabolisme 10,7 og lys signalering kaskade 14. Annotering av gen-funksjon via kombinerte genomikk, metabolomics og informatikk er ikke bare for biosyntetiske gen og direkte regulator av transkripsjon faktor, men også for å forstå fysiologisk prosess og respons (se eksempel Figur 3. 14). Å utvikle denne tilnærmingen fra modell planter til å beskjære arter, er metabolsk sammenligning av over plantearter kraftig tilnærming i noen generelle metabolisms. For eksempel, hvis samme forbindelsen blir oppdaget i forskjellige plantearter, og noen orthologous gener finnes i disse plantearter, kan krysse arter co-uttrykk analyse ved hjelp orthologous gener gi strong støtte for prediksjon din. Denne tilnærmingen kan utføres i Arabidopsis, poppel, Medicago, i tillegg viktige avlinger som bygg, ris, hvete og soyabønner, med co-uttrykk analyse av plantearter (6, Planet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,, 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> , se et eksempel, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Destillert vann ULC / MS Grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitril (ACN) ULC / MS karakter </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Metanol (MeOH) ULC / MS karakter </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Maursyre (HCOOH) ULC / MS karakter for væskekromatografi </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Standard forbindelser </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Lineær ion trap (IT) ESI-MS system Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC system Surveyor </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytisk kolonnen Luna C18 (2), 2,0 mm diameter, 150 mm lengde, 100 en porestørrelse og sfæriske partikler av tre mm </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur programvare </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Gitt den stadig voksende antall modell plantearter som komplette genomsekvenser er tilgjengelig, og overflod av bio-ressurser som knockout mutanter, ville tiltredelser og avanserte avlspopulasjoner, det er en økende byrde for genet funksjonell annotering. I denne protokollen, annotering av anlegget gen-funksjon ved hjelp av kombinerte co-uttrykk genet analyse, er metabolomics og informatikk forutsatt (figur 1). Denne tilnærmingen er basert på teorien om hjelp målgener med kjent funksjon for å tillate identifisering av ikke-kommenterte gener sannsynligvis vil bli involvert i en viss metabolsk prosess, med identifisering av målet forbindelser via metabolomics. Strategiene er fremmet for å bruke denne informasjonen på bestander som genereres av både framover og bakover genetikk tilnærminger til tross for ingen av disse er uanstrengt. Ved corollary denne tilnærmingen kan også brukes som en tilnærming for å karakterisere ukjente topper representerer nye eller spesielle secondary metabolitter i begrensede vev, plantearter eller stress behandling, som er den viktige rettssaken å forstå plante metabolisme.

Watch this Scientific Journal Video about Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics at JoVE.com

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Kombinasjon av genomikk, co-uttrykk genet analyse og identifisering av målet forbindelser via metabolisme gi genet funksjonell merknad.

Annotering av Plant Gene Function via Combined genomikk, metabolomics og informatikk

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Kombinert Immunofluorescence og DNA FISH på 3D bevarte Interphase Nuclei å studere endringer i 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule Frequency med Fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Split grønne fluorescerende Protein System å visualisere effektor levert fra bakterier under infeksjon

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Live Imaging av mikrokolonier med høy gjennomstrømning for å måle heterogenitet i vekst og genuttrykk

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

mirMachine: En one-Stop Shop for Plant miRNA-merknad

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Bestemmelse av trepartsinteraksjon mellom to monomerer av en MADS-boks transkripsjonsfaktor og et kalsiumsensorprotein av BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...