Name: analysis of cell cycle position in mammalian cells
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells at JoVE.com

De auteurs willen de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en de Canadese Cancer Society voor de financiering van de celcyclus onderzoek in hun laboratorium bedanken. MJC is een ontvanger van een MD / PhD-beurs van de CIHR. MJC en MA zijn lid van de CaRTT trainingsprogramma.

1. Etikettering en de bevestiging van de cellen <ol><li> Voeg 1 ul van celproliferatie Labeling Reagent (BrdU) per ml celkweekmedium (1 tot 1000 verdunning) 1 uur voor de oogst. De etikettering periode moet mogelijk worden verlengd voor de langzamer groeiende cellen. </li><li> Om de oogst cellen, aspireren kweekmedium en grondig wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal dit om grondig te verwijderen sporen van medium. </li><li> Snel wassen culturen een derde keer met PBS dat 3mm EDTA en zuig grondig. </li><li> Voeg een klein volume PBS, met 3 mm EDTA bij elk gerecht, 0,5 ml voor een 6 cm schotel is ideaal. Incubeer bij 22 ° C gedurende ongeveer 5 minuten aan cellen los te maken. Transfer naar een 15 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer cellen op 500 xg gedurende 5 minuten om pellet, verwijder supernatant, en resuspendeer grondig in 100 pi PBS. </li><li> Fix-cellen door toevoeging van 5 ml 95% EtOH, druppelsgewijs, terwijl de vortexen. In deze stap kunnen cellen worden bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste eenmaanden. </li></ol> 2. Denaturering en kleuring van BrdU en DNA <ol><li> Centrifugeer cellen op 500 xg gedurende 5 minuten te pellet cellen en verwijder 95% EtOH. Resuspendeer in 1 ml 2N HCl en 0,5% Tx-100 door het toevoegen van in een druppelsgewijs fashion tijdens het vortexen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifuge zoals eerder in paragraaf 2.1 en zorgvuldig aspireren supernatans, omdat de cellen vormen een zeer losse pellet bij deze stap. Voorzichtig hersuspenderen in 1 ml 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) en gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pellet cellen zoals hierboven in paragraaf 2.1 en resuspendeer in 0,5 ml van de antilichaam-oplossing (PBS dat 1% BSA en 0,2% Tween-20) met muis anti-BrdU-antilichamen verdund 1 tot 50. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Pellet-cellen opnieuw en opnieuw in suspensie in 50 ml van het antilichaam oplossing met konijn anti-muis secundaire antilichamen geconjugeerd met FITC verdund 1 tot 25. Incubeer gedurende 30 minuten opwerkblad en beschermen tegen licht. </li><li> Centrifuge cellen een laatste keer en resuspendeer in 0,5 ml propidiumjodide en RNase oplossing (PI-RNAse-oplossing, PBS met 1% BSA, 10 mg / ml propidiumjodide, 0,25 mg / ml RNase A) en incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Als alternatief RNA kan &#39;s nachts worden verteerd bij 4 ° C in het donker. </li><li> Passeren oplossing door een cel zeef om aggregaten te verwijderen en enkele cellen te verzamelen in een geschikt voor monster-opname op uw flowcytometer. Nogmaals, moeten monsters worden beschermd tegen directe blootstelling aan licht. </li></ol> 3. Analyse door flowcytometrie <ol><li> De cellen dienen te worden geanalyseerd door een standaard flowcytometer die in staat is te discrimineren doubletten (twee cellen die passeren de stroom cel als een) met de juiste detectie mogelijkheid voor propidiumjodide en FITC. Enkele cellen kunnen worden gedetecteerd in dit flowcytometrie aanvraag van gating voor evenementen op basis van forward scatter en zijwaartse verstrooiing popvraagd, en door gebruik te maken van de eigenschappen van DNA kleuring door propidiumjodide. Het uiterlijk van een doublet discriminerende puntenplot varieert tussen flowcytometers en vertrouwt op propidiumjodide kleuring eigenschappen, zie uw lokale flowcytometrie faciliteit voor advies over het opzetten van een doublet discriminator in uw analyse. In het algemeen, een asynchroon prolifererende populatie van cellen, enkele cellen zijn meestal de twee meest voorkomende pieken (2N en 4N DNA) in het doublet discriminerende plot en een hek moeten worden getrokken om hen heen. Hiermee selecteert u cel gebeurtenissen die worden gebruikt hieronder voor alle volgende analyse. </li><li> Het eerste monster te analyseren moet een asynchroon prolifererende cultuur die fungeert als een positieve controle voor kleuring en flowcytometer set-up te zijn. Pas de gevoeligheid van de fotomultiplicatorbuizen voor propidiumjodide kleuring zodanig dat de 2N en 4N pieken van singlet cellen zijn gecentreerd op 200 en 400 (willekeurige eenheden) op de X-as. We vaak een vlek overvloedige sals levering van deze cellen om ervoor te zorgen dat alle parameters van de flowcytometer naar behoren zijn aangepast zonder gebruik te maken van dit monster. Deze positieve controle is ook nuttig voor nieuwe gebruikers om meer vertrouwd te raken met de werking van de flowcytometer. </li><li> Pas de gevoeligheid van de fotomultiplicator buis voor FITC detectie zodanig dat G1 en G2 / M bevolking boven de achtergrond. BrdU-positieve cellen, moet ongeveer 10 keer helderder en de Y-as moet worden weergegeven als een logaritmische schaal. Het is soms handig om ook een negatieve controle voor BrdU kleuring (door vervanging van de anti-BrdU-antilichamen met niet-specifieke IgG in stap 2.3 hierboven) om een ​​duidelijk onderscheid positief gekleurde cellen. </li><li> Pas compensatie tussen propidiumjodide en FITC zodanig dat enkele gebeurtenissen gevangen genomen door de flowcytometer vormen een hoefijzervormige boog van G1 in de linker tot aan de S-fase en naar beneden in de rechter benedenhoek voor de G2 / M. Raadpleegt u het volgende verzoek om een ​​meer diepgaande discussie van de principes en het gebruik van flowcytometrie en verwijzingen daar in voor specifieke toepassingen 2. </li></ol> 4. Data-analyse <ol><li> 5 000 tot 10 000 cel evenementen met de gewenste reikwijdte van DNA-inhoud moet worden verzameld voor elk monster teneinde het vertrouwen dat de bevolking van cellen in de cultuur grondig bemonsterd zijn. </li><li> Zodra cellen zijn gemeten voor propidiumjodide en BrdU content die ze nodig hebben om te worden toegewezen aan de G1, S of G2 / M fasen. Doe dit door het opstellen hekken rond de twee BrdU negatieve populaties gecentreerd op 200 en 400 (G1 en G2 / M respectievelijk). Alles wat boven deze dozen moeten worden opgenomen in een enkele poort die de S-fase (fig. 1A) maatregelen. Het percentage van de cellen in elke poort staat voor het relatieve aantal cellen in de G1, S en G2 / M (Fig. 1B). </li></ol> 5. Alternatief protocol voor de analyse van celcyclus in een gemengde populatie van cellen <ol><li> Deze alternatieve protocol ishet meest nuttig wanneer transfectie van expressievectoren routinematig resulteert in een laag percentage van cellen die het gen product van belang, of wanneer de behandeling met geneesmiddelen om een ​​zuivere populatie van cellen te selecteren onpraktisch is. Dit resulteert in een relatief klein deel van de cellen van belang zijn besmet met een grote populatie van untransduced cellen. In dit geval, co-transfecteren plasmiden het uiten van je gen of shRNA van belang, samen met een plasmide dat een marker uitdrukt voor het detecteren van getransfecteerde cellen door flowcytometrie, zoals een membraan verankerd GFP 3, of een vreemde celoppervlak marker, zoals CD 19 4 of CD20 5. </li><li> Voor de toepassing van dit protocol zullen we CD20 vlekken te gebruiken als een voorbeeld, maar kleuring voor CD19 is in wezen identiek. In het geval van transfectie met CD20, is er geen noodzaak om BrdU label, eenvoudigweg oogst cellen zoals beschreven in de stappen 1,2 tot 1,5 hoger en vlekken door het toevoegen van 20 pi FITC-geconjugeerd anti-CD20 antilichamen tegen de cellen op ice gedurende 20 minuten in het donker. Fix-cellen zoals beschreven in stap 1.6. Cellen kunnen weer worden opgeslagen voor minstens een maand bij 4 ° C in het donker. Voor de detectie van GFP, laat het antilichaam vlekken van deze stap en vast te stellen en op te slaan cellen zoals beschreven. </li><li> Re-hydraat de cellen door pelleteren in de centrifuge op 500 xg gedurende 5 minuten en resuspenderen in 5 ml PBS dat 1% BSA. </li><li> Re-pellet de cellen op 500 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer cellen in 0,5 ml propidiumjodide en RNase oplossing zoals hierboven beschreven in paragraaf 2.5. </li><li> Blijf celpreparaat instructies op te volgen in 2.6 en analyse van de instructies in de punten 3.1 en 3.2. </li><li> Pas de gevoeligheid van de fotomultiplicator buis voor FITC detectie zodanig dat ongekleurde cellen boven de achtergrond. Idealiter zal CD20-positieve cellen worden FITC 10x tot 100x intenser gekleurd dan de achtergrond en de Y-as van deze grafiek moet worden weergegeven als een logaritmische schaal (Fig. 2A). CD20 positieve cellen die 10x helderder dan backgronde (en met propidiumjodide kleuring tussen de 200 en 400) moet worden geselecteerd voor weergave in een propidiumjodide versus-cel-tellingen histogram zoals getoond in Fig. 2C. Voor cellijnen die markers die gemakkelijk zijn helder gekleurd (dwz 10X tot 100X boven achtergrond) de CD20 positieve cut-off moet worden vastgesteld op 10X achtergrond te drukken. Opname van zwakkere kleuren van cellen verhoogt variabiliteit in deze experimenten, waarschijnlijk omdat het gen van belang is ook zwak uitgedrukt in deze cellen. Voor cellijnen die alleen rendement zwak gekleurd CD20-positieve (dwz minder dan 10x achtergrond), vaststelling van een afgesneden moet worden gemaakt met behulp van een negatieve controle bestaat uit CD20 gekleurde, ongetransfecteerde cellen. </li><li> Tenminste 1000 CD20 positieve gebeurtenissen moeten worden verzameld voor elk monster. Experimenten met minder dat 1000 evenementen van hoge variabiliteit. Softwarepakketten zoals ModFit LT (Verity Software), Multi Cycle AV (Phoenix Flow Systems), en Flow Jo (Tree Star) te gebruiken wiskundige schattingen vande G1, S en G2 / M populaties die bijdragen aan de vorm van de curve in de histogrammen, zoals die getoond in Fig. 2B en C. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Wij bieden drie voorbeelden van experimentele celcyclus analyses met behulp van onze aanpak. De eerste maakt gebruik van retrovirale expressie van cycline afhankelijke kinase remmer p27KIP1 in muis embryonale fibroblasten. Vierentwintig uur na de drug selectie voor virale infectie was voltooid, werden de cellen puls gemerkt met BrdU gedurende een uur. In dit experiment ectopische expressie van de remmer wordt gebruikt om de proliferatie van de cellen (Fig. 3A en B) te arresteren. Zoals getoond in Fig. 3B weinig BrdU positieve gebeurtenissen zijn duidelijk in de S-fase gate in reactie op p27. Ook het percentage cellen in de S-fase voor p27 tot expressie brengen is vrij laag als diagramed in Fig. 3C. Dit soort analyse is zeer effectief in het karakteriseren van de controle van de celcyclus defecten in cellen afkomstig zijn van verschillende stammen van geen-gerichte muizen 6, 7, 8. In het tweede experiment werden ongetransformeerde mamma-epitheel cellen (MCF10A) behandeld met de groei-remmende cytokine, transforming growth factor beta een (TGF-β1) voor 24 uur. Cellen werden gemerkt met BrdU gedurende vier uur onmiddellijk voorafgaand aan de oogst. Zoals getoond in Fig. 4 BrdU etikettering in de S-fase cellen is sterk verminderd door TGF-β1 signalering, is de specificiteit van onze kleuren ook gevalideerd met een IgG negatieve controle (fig. 4C). Kwantificering van de verschillende fasen van de celcyclus bevestigt dat TGF-β1 voornamelijk proliferatie remt in de G1 fase van de celcyclus, wat leidt tot een accumulatie in deze fase. In ons laatste voorbeeld, zijn PRB tekort Saos-2 cellen getransfecteerd met een CMV-CD20 expressievector en een CMV-RB of CMV-β-Gal als een controle. Drie dagen na transfectie werden de cellen geoogst, gekleurd, en vaste. Flowcytometrie analyse van deze cels is te zien in Fig. 5. Dit toont de celcyclus verdeling van de negatieve controle getransfecteerde cellen (Fig. 5A) in vergelijking met de distributie volgende 72 uur van PRB expressie (Fig. 5B). Volgende curve fitting door Multi Cycle-software, is een directe vergelijking van het aandeel van de fasen van de celcyclus getoond in Fig. 5C. Dit onthult de ophoping van cellen in de G1 na PRB expressie en de relatieve afname van cellen uit de S-en G2 / M fasen. We hebben gebruik gemaakt variaties op deze test aan G1 arrestatie mechanismen uitgebreid 9, 10, 11, 12, 13 probe. Deze voorbeelden laten zien hoe controle van de celcyclus kan worden gemeten in reactie op een verscheidenheid van stimuli of cel manipulaties. Deze aanpak kan dus aangepast worden aan vele toepassingen die het meten van de celcyclus positie in de cultuur van het type experimenten vereisen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> Figuur 1. Quantitatie van de fasen van de celcyclus door gecombineerde propidiumjodide en BrdU kleuring (PI-BrdU). (A) Dit paneel geeft drie dimensionale flow cytometrie van propidiumjodide en BrdU gekleurde cellen. Merk op dat cellen met 2N en 4N DNA-inhoud worden gecentreerd over de 200 en 400 tekens op de X-as schaal voor propidiumjodide kleuringsintensiteit. BrdU kleuring intensiteit wordt gemeten op een logaritmische schaal op de Y-as. Let op de positie van de poorten gebruikt om cellen te kwantificeren in de G1, S en G2 / M fasen van de celcyclus. (B) Het relatieve aandeel van de cellen in elk van de G1, S en G2 / M gates van A worden getoond op deze grafiek. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> Figuur 2. Kwantificering van fasen van de celcyclus in de geselecteerde cellen met behulp van propidiumjodide en het celoppervlak marker CD20. (A) Dit paneel propidiumjodide en CD20 aankleuring voor een mengsel van cellen laat zien, waarvan sommige ectopisch uitdrukken CD20 en PRB. Merk op dat de cellen met2N en 4N DNA (het meest voorkomende populaties) zijn gecentreerd boven de 200 en 400 punten op de X-as. De positie van de CD20 + poort selecteert cellen die zijn gekleurd minstens 10x feller dan de achtergrond. (B) Een grafiek van het bloedbeeld versus propidiumjodide kleuring is getoond voor CD20 negatieve cellen in panel A, die asynchroon vermenigvuldigen. (C) Een soortgelijke grafiek wordt weergegeven voor CD20 positieve cellen van panel A die zijn geïnduceerd te arresteren met PRB expressie en cellen met in de eerste plaats 2N DNA inhoud bevatten. Dit toont aan dat een aangehouden sub-populatie kan worden onderscheiden van andere cellen in deze cultuur het gebruik van deze vlekken techniek. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> Figuur 3. Remming van de celproliferatie door p27KIP1. (A) PI-BrdU-analyse wordt gebruikt om de fasen van de celcyclus te meten in een asynchroon prolifererende populatie van cellen die werden getransduceerd met een lege pBabe retroviraal vector. (B) Een soortgelijke analyse van cellen getransduceerd met pBabe-p27. Let op de afwezigheid van cellen in de S-fase en een grotere intensiteit van de gebeurtenissen in de G1 en G2 / M poorten. (C) Kwantificering van cellen in de respectievelijke fasen van de celcyclus in asynchroon prolifererende controle en p27 tot expressie brengen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> Figuur 4. Remming van celproliferatie door TGF-β1 (A) PI-BrdU analyse van asynchroon prolifererende MCF10A cellen. (B) analyse van cellen behandeld met 100 pM van TGF-β1 voor 24 uur. Let op de accumulatie van cellen in de eerste plaats in de G1 fase van de celcyclus. (C) Validatie van BrdU kleuring door het vervangen van de anti-BrdU primaire antilichaam met een niet-specifieke IgG controle in asynchroon prolifererende cellen. (D) Grafische kwantificering van de respectievelijke fasen van de celcyclus van A en B. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; Figuur 5. Remming van de celproliferatie door PRB. (A) Cell telt versus propidiumjodide kleuring van CD20 en ß-gal getransfecteerde cellen wordt getoond. Dit is een belangrijk controle transfectie kan deels synchroniseren cellen, waardoor de ongetransfecteerde bevolking (CD20 - cellen) als een ongepaste controle voor de getransfecteerde sub-populatie. Getransfecteerde cellen moeten worden vergeleken met andere analoge getransfecteerde cellen. (B) Cell telt versus propidiumjodide grafiek van CD20 en PRB getransfecteerde cellen. Let op de bijna exclusieve aanwezigheid van een 2N piek. (C) Grafische weergave van de fase van de celcyclus proporties bepaald op basis van A en B met behulp van curve fitting methoden in Multi Cycle software.

<ol>
	<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+introduction.">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li><li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker,+Us9-GFP,+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li><li>Qin, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action.">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li><li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control.">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li><li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions.">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li><li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development.">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li><li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin.">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li><li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation.">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li><li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein.">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities.">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li><li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins.">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins.">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In onze ervaring, succes met deze technieken is afhankelijk van een paar belangrijke controles en experimentele omstandigheden. Een daarvan is de oprichting van een asynchroon prolifererende controle voor gebruik in deze experimenten. Deze controle dient drie belangrijke doelen. Ten eerste, het zorgt ervoor dat kweekomstandigheden gebruikt voor alle experimentele monsters voldoende zijn om voortdurende proliferatie te ondersteunen in de afwezigheid van de behandeling. Dit voorbeeld dient ook het doel van een positieve controle voor de kleuring methodologie om ervoor te zorgen dat BrdU of CD20 positieve cellen kunnen worden gedetecteerd wanneer ze aanwezig zijn. Ten slotte is dit monster gebruikt om de flowcytometer kalibreren. Deze controle monster kan worden gebruikt om propidiumjodide kleuringsintensiteit aan te passen aan 2N en 4N-cellen te detecteren respectievelijk op 200 en 400. Bovendien kan detectie gevoeligheid van BrdU of CD20 worden aangepast, zodat negatieve en positieve signalen zijn gecentreerd zoals getoond in de figuren 1A en 2A. Wanneer alle monsters hebben een vergelijkbare concentratie van cellen in de PI-RSneep oplossing, daarna enkele aanpassingen van de cytometer zijn nodig als de volgende monsters worden uitgevoerd. Dit is belangrijk om redenen die getoond in Fig. 4B en 5B waar sterke G1 ophoping ontstaat in wezen een G1 piek die kunnen worden geïnterpreteerd als G2 / M. De vertegenwoordiger experimenten ook andere belangrijke punten. Allereerst tonen ze aan dat BrdU opname en de etikettering kunnen variëren tussen celtypen. Om deze reden is het belangrijk om empirisch bepalen van de lengte van de puls en vlekken voorwaarden die nodig zijn om adequaat te cellen te detecteren in de S-fase. In het algemeen kan celtypen die in cultuur verdubbelen in 24 uur of minder worden geëtiketteerd met BrdU in een uur. Langzamer groeiende celtypen kunnen langere pulsen en aanpassen van de antilichamen vlekken voorwaarden en duur. MCF10A cellen zijn een goed voorbeeld in dit opzicht als ze waren gemerkt met BrdU voor vier uur en gekleurd met tweemaal de standaard concentratie van antilichamen voor vier keer zo lang. Onderzoekersmoet oppassen niet tot 6 uur van BrdU hoger zijn dan de etikettering, zelfs met een zeer langzaam groeiende cellen, want dit kan ten onrechte leiden tot opname van de G2 / M cellen in de S-fase bevolking. Ten tweede, bij het vergelijken van de effecten van p27KIP1 expressie met die van TGF-β1, is het duidelijk dat p27 kan een ophoping in een G1 of G2 / M fasen veroorzaken terwijl TGF-β1 signalering induceert een G1 te arresteren. Traditionele middelen voor het opsporen van proliferatie zoals 3 H-thymidine en scintillatietelling zijn niet in staat om deze mogelijkheden te onderscheiden. In ons alternatief protocol tonen we de detectie van een subpopulatie van cellen in een grotere ongetransfecteerde bevolking. Het is belangrijk om empirisch vast te stellen de meest geschikte verslaggever voor het opsporen van getransfecteerde cellen. In onze ervaring bepaalde celtypes hetzij uitdrukkelijk celoppervlaktemerkers slecht, of niet goed het verkeer ze aan de plasmamembraan, wat resulteert in een onvermogen om getransfecteerde cellen te detecteren. Likewise, niet alle cellen tolereren het membraan-gebonden vorm van GFP. Selectie van de meest geschikte verslaggever te worden gemaakt door het beoordelen van transfectie-efficiëntie van de journalist als de relatieve intensiteit van meningsuiting ten opzichte van ongetransfecteerde controles. Idealiter zullen heterologe expressie van deze moleculen goed verdragen en dit is suggestief dat de markers weinig tot geen effect op de celcyclus distributie. Een beperking van dit soort van flow cytometrie benaderingen is dat ze alleen in staat zijn om de relatieve abundanties van de fasen van de celcyclus te stellen ten opzichte van elkaar. Om deze reden is het dubbelzinnig als uitdrukking van p27 in figuur 3 een echt induceert een arrestatie in G1 en G2 / M, of als het gewoon vertraagt ​​progressie door deze fases ten opzichte van de S-fase. Deze mogelijkheden kunnen verder worden onderzocht door het behandelen van een parallelle monster van cellen met een mitotische-remmer, zoals nocodazole, of G1 / S-remmer zoals aphidicolin. Omdat deze geneesmiddelen maken een dominant arrestatie in M-fase of vroeg de S-fase respectievelijk, zal langzaam prolifererende cellen zich ophopen op de drug geïnduceerde arrestatie punt. Bijvoorbeeld cellen gearresteerd in G1 als gevolg van PRB uiting zullen blijven in G1, ondanks nocodazole behandeling, terwijl controle cellen zullen zich ophopen in de M-fase 13. Tezamen bieden deze experimentele benaderingen bieden een flexibele methode die kan worden toegepast op een breed scala van zoogdieren celcyclus onderzoeksvragen. Ze kunnen gemakkelijk te detecteren veranderingen in de voortgang van de celcyclus en te kwantificeren verschillen vergeleken met de controlegroepen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Celproliferatie Labeling reagens </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU Antilichamen </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse FITC geconjugeerde antilichamen </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Cel Strain Filters </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD20 antilichamen </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Multi Cycle Software </td><td> Phoenix Flow Systems </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

De regulering van celproliferatie staat centraal in het weefsel morfogenese tijdens de ontwikkeling van meercellige organismen. Bovendien, verlies van controle van celproliferatie ten grondslag aan de pathologie van ziekten zoals kanker. Als zodanig is er grote behoefte is om te kunnen celproliferatie te onderzoeken en het aandeel van de cellen in elke fase van de celcyclus kwantificeren. Het is ook van vitaal belang voor zonder onderscheid te identificeren cellen die hun DNA repliceren binnen een grotere populatie. Aangezien een cel de beslissing om te woekeren is gemaakt in de G1-fase onmiddellijk voor het begin van DNA-synthese en het doorlopen van de rest van de celcyclus, detectie van DNA-synthese in deze fase zorgt voor een eenduidige bepaling van de status van groeiregulatie in celkweek experimenten. DNA-inhoud in de cellen kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door middel van flowcytometrie van cellen gekleurd met propidiumjodide, een fluorescente DNA intercalerende kleurstof.Op dezelfde manier kan actief DNA-synthese worden gekwantificeerd door het kweken van cellen in de aanwezigheid van radioactief thymidine, het oogsten van de cellen, en het meten van de opname van radioactiviteit in een zuur onoplosbare fractie. We hebben veel expertise met de celcyclus analyse en adviseren een andere aanpak. We onderzoeken celproliferatie met broomdeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (afgekort gewoon als BrdU) kleuring dat de integratie van deze analogen thymine detecteert in recent gesynthetiseerd DNA. Etikettering en de kleuren cellen met BrdU, gecombineerd met een totale DNA kleuring door propidiumjodide en analyse door flowcytometrie een biedt u de meest nauwkeurige meting van cellen in de verschillende stadia van de celcyclus. Het is onze voorkeur, want het combineert de detectie van actieve DNA-synthese, door middel van antilichaam gebaseerde kleuren van BrdU, met een totale DNA-inhoud van propidiumjodide. Dit maakt het mogelijk om duidelijke scheiding van cellen in G1 uit fase vroeg S, of laat de S-fase van de G2 / M.Bovendien kan deze aanpak worden gebruikt om de effecten van de vele verschillende cel-stimuli en farmacologische agenten te onderzoeken over de regulering van de voortgang door middel van deze verschillende fasen van de celcyclus. In dit rapport beschrijven we methoden voor de etikettering en de kleuren van gekweekte cellen, evenals hun analyse van flowcytometrie. We hebben ook experimentele voorbeelden van hoe deze methode kan worden gebruikt om de effecten van de groei remmen signalen van cytokines zoals TGF-β1, en proliferatieve-remmers, zoals de cycline afhankelijke kinase remmer, p27KIP1 te meten. We hebben ook een alternatief protocol die het mogelijk maakt voor de analyse van celcyclus positie in een subpopulatie van cellen in een grotere cultuur 5. In dit geval hebben we laten zien hoe je een celcyclus te detecteren in cellen getransfecteerd met het retinoblastoom-gen, zelfs als sterk overtroffen door ongetransfecteerde cellen in dezelfde cultuur. Deze voorbeelden illustreren de vele manieren waarop DNA kleuring enflowcytometrie kan worden gebruikt en aangepast aan de fundamentele vragen van zoogdieren celcyclus controle te onderzoeken.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells at JoVE.com

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Het bepalen van de celcyclus positie van een populatie van cellen, of begrijpen hoe signalen proliferatie van invloed zijn, gemakkelijk kan worden gemeten door middel van flowcytometrie gebruik van dit protocol. We brengen verslag uit een eenvoudige experimentele benadering voor vlekken cellen en kwantificeren van hun positie in de cel cyclus.

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Unit 1

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy (Video) | JoVE

Op lange termijn Imaging zoogdiercellen met behulp van Wide-Field Microscopie

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE

Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells (Video) | JoVE

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection (Video) | JoVE

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes (Video) | JoVE

Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Meting van Heme Synthesis Levels in zoogdiercellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...