Name: isolation and purification of kinesin from drosophila embryos
Uploaded: 2012-04-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos at JoVE.com

شكر خاص لنجاي وجايسون كريس ديل ريو لما قدموه من دعم ومساعدة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل من قبل RO1 منحة GM070676 إلى الإشتراكي.

ويمكن شراء سلالات الذباب وتضخيمها في المختبر. اعتمادا على كمية من قوارير ثقافة ذبابة الفاكهة وردت، لا يحتاج المرء إلى كثير من الأحيان &#39;الوجه&#39; في قارورة والثقافة، ومرة واحدة في قارورة وصلت الطاقة الإنتاجية القصوى. والتضخيم يستمر حتى يتم شغل ما يقرب من 50 قارور...

<ol>
	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

الدماغ البقري هو المادة الأكثر استخداما على نطاق واسع بدءا من 11 إلى تنقية كاملة الطول كينيسين، على الرغم من واستخدمت في الدماغ الفئران وكذلك 12. والعيب الكبير في استخدام الدماغ البقري كمصدر كينيسين هو توافر المواد الطازجة بدءا: المسالخ وعادة ما تكون غير ق?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف أو المواد </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> أجار (حبيبات) </td><td> الصياد </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> سكر العنب (مد الجلوكوز) اللامائى </td><td> الصياد </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> أطباق بتري </td><td> بيكتون </td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mm ستايل (البوليستر) 20/bag </td></tr><tr><td> ذبابة الفاكهة الثقافة قوارير </td><td> الاتحاد الدولي للدراجات </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البطين الثلاثي القرون الكأس </td><td> ECONO مختبر شركة </td><td> B700-100 </td><td> حجم: 100ML، الحجم: 58x72mm </td></tr><tr><td> خميرة </td><td> النجم الاحمر </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> شبكة النايلون </td><td> Genesse العلمية </td><td> 57-102 </td><td> 120 مicron حجم المسام </td></tr><tr><td> شبكة النايلون </td><td> أجزاء صغيرة </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب </td><td> سيغما </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب </td><td> سيغما </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> سيغما </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (اللامائى) </td><td> الصياد </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> سيغما </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> سيغما </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotأونين </td><td> سيغما </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> تامى </td><td> سيغما </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> سيغما </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> التاكسول </td><td> سيغما </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP التناظرية 5&#39;-أدينيليل imidodiphosphate </td><td> سيغما </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> مالينكرودت </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> سيغما </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon مرشحات الترا الطرد المركزي: 0.5 مل، 100kD قطع (8)، حزمة </td><td> ميليبور </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

البروتينات محرك نقل الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة، ونقلهم إلى مواقع فرعية الخلوية محددة. ولأن يقترح نقل تغييرها لتشكل أساس مجموعة متنوعة من أمراض الاعصاب، فهم نقل أنيبيب محرك أساس ولائحته من المرجح أن يؤدي في نهاية المطاف إلى تحسين الطرق العلاجية. كينيسين-1 هو بروتين محرك حقيقية النواة التي تتحرك في اتجاه تقدمي (زائد النهاية) على طول الأنابيب الدقيقة (MTS)، والمدعوم من التحلل المائي للاعبي التنس المحترفين. نحن هنا نورد بروتوكول تنقية مفصل لعزل نشط كينيسين طول كامل من أجنة ذبابة الفاكهة، مما يسمح للمزيج من الوراثة ذبابة الفاكهة مع دراسات البيوفيزيائية واحدة جزيء. بداية مع ما يقرب من 50 أكواب زرع، مع ما يقرب من 1000 من الإناث في الكأس، وأجرينا مجموعات بين عشية وضحاها. قدمت هذا ما يقرب من 10 مل من أجنة معبأة. وكانت الأجنة تبييض dechorionated (استسلام حوالي 9 غرامات من الأجنة)، وبعد ذلك المتجانس. AFثالثا انقطاع، وأوضح أن جناسة باستخدام تدور بسرعة منخفضة تليها الطرد المركزي عالية السرعة. تمت معالجة طاف مع توضيح GTP والتاكسول إلى تتبلمر MTS. وثبتوا على النظام التجاري المتعدد الأطراف كينيسين بلمرة بإضافة التناظرية للاعبي التنس المحترفين، 5&#39;-أدينيليل imidodiphosphate في درجة حرارة الغرفة. بعد ملزم كينيسين، وsedimented ميكروتثبول عن طريق الطرد المركزي بسرعة عالية من خلال وسادة السكروز. وكان بيليه أنيبيب ثم إعادة وقف التنفيذ، وتكررت هذه العملية. أخيرا، تمت إضافة للاعبي التنس المحترفين للافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف. ارتفاع سرعة الطرد المركزي نسج ثم تراجع النظام التجاري المتعدد الأطراف، وترك كينيسين في طاف. وقد تعرض هذا كينيسين لترشيح الطرد المركزي باستخدام قطع 100 دينار كويتي من مرشح لمزيد من تنقية، aliquoted، المفاجئة مجمدة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية. تم تنفيذ SDS هلام الكهربائي والغربية النشاف باستخدام عينة تنقيته. والنشاط الحركي للعينات تنقيته قبل وبعد خطوة الترشيح الطرد المركزي النهائيتم تقييم استخدام واحد في المختبر فحص جزيء أنيبيب. وأظهرت الكسور كينيسين قبل وبعد الترشيح الطرد المركزي processivity كما ذكرت سابقا في الأدب. تجارب أخرى تجرى حاليا لتقييم التفاعل بين كينيسين وبروتينات النقل الأخرى ذات الصلة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos at JoVE.com

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

هذا هو بروتوكول لعزل نشط كينيسين طول كامل من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة لواحدة جزيء دراسات البيوفيزيائية. نبين كيفية جمع الأجنة، وجعل المحللة جنين، وتتبلمر ثم ميكروتثبول (MTS). يتم تنقيته بواسطة شل حركة كينيسين على النظام التجاري المتعدد الأطراف، والغزل أسفل المجمعات كينيسين-طن متري، ومن ثم الافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف عن طريق إضافة للاعبي التنس المحترفين.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...