Name: isolation and purification of kinesin from drosophila embryos
Uploaded: 2012-04-27T12:00:00
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Un merci spécial à Kris Ngai et Jason Del Rio pour leur soutien et leur aide dans ce projet. Ce travail a été soutenu par RO1 subvention GM070676 à SPG.

Les souches de mouches peuvent être achetés et amplifié dans le laboratoire. Selon la quantité de flacons de culture de Drosophila reçues, un besoin de fréquemment &quot;retourner&quot; les flacons de culture, une fois les flacons a atteint sa capacité maximale. L&#39;amplification se poursuit jusqu&#39;à environ 50 flacons de culture de Drosophila sont remplis. On fait alors «voler tasses&quot; avec 100 ml béchers tricorne (Fly décision tasse est discuté dans la section suivante). Après 2...

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	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

Cerveau bovin est le matériau le plus utilisé à partir du 11 pour purifier pleine longueur kinésine, si le cerveau murin a été utilisé comme puits 12. Un inconvénient important de l&#39;aide cerveau bovin comme source kinésine est la disponibilité de matériau de départ fraîche: les abattoirs sont généralement inaccessibles, et le cerveau doit être extrêmement frais afin d&#39;obtenir kinésine active. En outre, seuls les cerveaux des jeunes vaches sont efficaces. Enfin, la manipula...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif ou du matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Agar (granulé) </td><td> Pêcheur </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose (D-glucose) anhydre </td><td> Pêcheur </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> Boîtes de Pétri </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> Style de 60x15mm (Polyester) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila flacons Culture </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bécher Tricorne </td><td> Econo Lab Inc </td><td> B700-100 </td><td> Volume: 100ml, taille: 58x72mm </td></tr><tr><td> Levure </td><td> Red Star </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon Mesh </td><td> Genesse scientifique </td><td> 57-102 </td><td> 120 mla taille des pores Icron </td></tr><tr><td> Nylon Mesh </td><td> Petites pièces </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (anhydre) </td><td> Pêcheur </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> AprotOnin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> IST </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP analogique 5&#39;-adénylate imidodiphosphate </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Filtres Ultra centrifuges: 0,5 ml, 100 kD coupés, 8 paquets </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

Protéines motrices transporter des marchandises le long des microtubules, et les transporter à des sous-cellulaires endroits. Parce que le transport modifié est proposé à la base une variété de maladies neurodégénératives, la compréhension des microtubules du transport basé à moteur et de son règlement sera probablement finalement conduire à l&#39;amélioration des approches thérapeutiques. Kinésine-1 est une protéine eucaryote moteur qui se déplace dans une direction antérograde (plus fin) le long des microtubules (MT), généré par hydrolyse de l&#39;ATP. Nous rapportons ici un protocole de purification pour isoler détaillée actif kinésine pleine longueur à partir d&#39;embryons de drosophile, ce qui permet la combinaison de génétique de la Drosophile avec une seule molécule d&#39;études biophysiques. À partir avec environ 50 tasses de pose, avec environ 1000 femmes par tasse, nous avons réalisé des collections pendant la nuit. Cela a fourni environ 10 ml d&#39;embryons emballés. Les embryons ont été l&#39;eau de Javel dechorionated (ce qui donne environ 9 grammes d&#39;embryons), puis homogénéisé. Afperturbations ter, l&#39;homogénat a été précisé en utilisant une vitesse d&#39;essorage à faible suivie d&#39;une centrifugation à grande vitesse. Le surnageant clarifié a été traitée avec GTP et le taxol à polymériser MT. Kinésine a été immobilisé sur polymérisé par addition MT l&#39;analogue de l&#39;ATP, 5&#39;-adénylate imidodiphosphate à la température ambiante. Après kinésine contraignant, les microtubules ont été sédimentées par centrifugation à grande vitesse grâce à un coussin de saccharose. Le culot a été microtubules ensuite remis en suspension, et ce processus a été répété. Enfin, l&#39;ATP a été ajouté à libérer la kinésine de la MT. Centrifugation à grande vitesse, puis filé vers le bas de la MT, laissant la kinésine dans le surnageant. Cette kinésine a été soumis à une filtration centrifuge en utilisant une réduction de 100 KD hors du filtre pour une purification supplémentaire, aliquotés, enclenchez congelés dans l&#39;azote liquide, et conservés à -80 ° C. Électrophorèse sur gel SDS et western blot a été réalisée en utilisant l&#39;échantillon purifié. L&#39;activité motrice des échantillons purifiés avant et après l&#39;étape finale de filtration centrifugea été évaluée en utilisant un test in vitro molécule microtubules unique. Les fractions kinésine avant et après la filtration centrifuge montré processivité comme précédemment rapporté dans la littérature. D&#39;autres expériences sont en cours pour évaluer l&#39;interaction entre kinésine et autres protéines de transport connexes.

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Il s&#39;agit d&#39;un protocole d&#39;isoler actif Kinesin pleine longueur à partir de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons pour une seule molécule d&#39;études biophysiques. Nous montrons comment collecter les embryons, faire le lysat d&#39;embryons, puis polymériser microtubules (MTs). Kinesin est purifié par l&#39;immobiliser sur le SCM, la filature par les complexes Kinesin-MT, puis en relâchant la kinésine de la MT par addition d&#39;ATP.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

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