Name: isolation and purification of kinesin from drosophila embryos
Uploaded: 2012-04-27T12:00:00
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このプロジェクトの支援と支援のためのクリス·ガイ、ジェイソン·デル·リオに感謝します。この作品は、RO1 SPGへの助成金GM070676によってサポートされていました。

ハエの株は、ラボで購入して増幅することができる。受信されたショウジョウバエ培養バイアルの量に応じて、一つは頻繁に一度バイアルが最大容量に達しており、文化バイアルを&quot;反転&quot;する必要があります。約50 ショウジョウバエの培養瓶がいっぱいになるまで増幅が続行されます。一つは、その後（カップ意思フライ次のセクションで説明されています）100ミリリッ?...

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	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

マウス脳は同様に12使用されているものの、ウシの脳は、フルレングスキネシンを精製するために最も広く使用されている出発材料11である。キネシン源としてウシの脳を使用しての大規模な欠点は、新鮮な原料の可用性です。屠殺場は、通常アクセスできないと、脳はアクティブキネシンを得るために非常に新鮮でなければなりません。さらに、若い牛の脳だけが有効であ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や材料の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>寒天（顆粒） </td><td>フィッシャー</td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td>デキストロース（D-グルコース）を無水</td><td>フィッシャー</td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ベクトン</td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mmスタイル （ポリエステル）20/bag </td></tr><tr><td> ショウジョウバエ培養バイアル</td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td>トライコーンのビーカー</td><td>エコノ研究所（株） </td><td> B700-100 </td><td>容量：100ミリリットル、 サイズ：58x72mm </td></tr><tr><td>酵母</td><td>赤色星</td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td> Genesse科学</td><td> 57から102 </td><td> 120メートルicron孔サイズ</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td>スモールパーツ</td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>シグマ</td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>シグマ</td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマ</td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4（無水） </td><td>フィッシャー</td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td>シグマ</td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>シグマ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> APROT応仁の乱</td><td>シグマ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td>シグマ</td><td> 178403から8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td>カルビオケム</td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td>シグマ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td>タクソール</td><td>シグマ</td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATPアナログの5&#39;-アデニル酸imidodiphosphate </td><td>シグマ</td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>マリンクロット</td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td>シグマ</td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ遠心フィルタ：0.5 mLを、100kDのカットオフ、8本パック</td><td>ミリポア</td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

モータータンパク質は微小管に沿って貨物を移動し、特定のサブ携帯の場所にそれらを運ぶ。変更されたトランスポートが微小管に基づいてモータの輸送とその調節を理解し、神経変性疾患の様々な根底にあることが示唆されているため、おそらく最終的に改良された治療法につながる。キネシン-1はATPの加水分解により微小管の電源（MTS）に沿って順行性（プラス端）方向に移動する真核生物のモータータンパク質である。ここでは、このように、単一分子生物物理学の研究とショウジョウバエの遺伝学の組み合わせを可能にする、 ショウジョウバエの胚からアクティブな完全な長さのキネシンを分離するための詳細な精製プロトコールを報告します。カップ当たり約1000人の女性で、約50敷設カップを皮切りに、我々は一晩のコレクションを行った。これは、パックされた胚の約10ミリリットルを提供した。胚（胚の約9グラムが得られる）dechorionated漂白剤であったし、ホモジナイズした。 AFTERの中断は、ホモジネートを高速遠心分離に続いて低速のスピンを用いて明らかにした。明らかに上清は、MTSを重合させるGTPおよびタキソールで処理した。キネシンは、ATPアナログ、室温で5&#39;-アデニル酸imidodiphosphateを追加することにより、重合MTの上に固定化されました。キネシンの結合した後、微小管は、ショ糖クッションを介して高速遠心分離を介して沈殿させた。微小ペレットを再懸濁し、このプロセスが繰り返されました。最後に、ATPはMTSからキネシンを解放するために追加されました。高速遠心分離し上清中にキネシンを残して、MTをスピンダウン。このキネシンは、さらに精製するためにフィルタ100 KDカットオフを使用して遠心濾過し、分注し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存されているにスナップブロッティングSDSゲル電気泳動とウェスタン精製サンプルを用いて行った。最後の遠心濾過工程の前と後精製したサンプルの運動in vitroで単一分子の微小管のアッセイで用いて評価した。遠心濾過前と後のキネシン分画は、以前に文献で報告されているように（processivity）を示した。さらに実験では、キネシンやその他の輸送関連タンパク質間の相互作用を評価するために進行中です。

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

これからアクティブ全長キネシンを分離するためのプロトコルです。<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;単一分子生物物理学の研究のための胚。我々は、胚を収集する胚溶解液を作成し、その微小管（MTS）を重合する方法を示しています。キネシンは、MTSでそれを固定するキネシン-MT複合体をスピンダウンし、ATPの添加によってMTSからキネシンを解放することによって精製される。

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

の単離と精製ショウジョウバエ</em磁気ビーズソート別>末梢ニューロン

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

の直立イメージングショウジョウバエ胚

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

アン in vivoで</emからのタンパク質複合体を分離するために>架橋アプローチショウジョウバエ胚

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...