Name: isolation and purification of kinesin from drosophila embryos
Uploaded: 2012-04-27T12:00:00
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Agradecimentos especiais a Kris Ngai e Jason Del Rio, pelo apoio e ajuda neste projeto. Este trabalho foi apoiado por RO1 concessão GM070676 para SPG.

Cepas de moscas pode ser comprado e amplificado no laboratório. Dependendo da quantidade de frascos de cultura de Drosophila recebidos, uma necessidade de frequência &#39;flip&#39; os frascos de cultura, uma vez que os frascos atingiu a capacidade máxima. A amplificação continua até cerca de 50 frascos de cultura de Drosophila estão cheios. Um, em seguida, faz &quot;voar copos&quot; com 100 ml tricorn copos (Fly tomada copo é discutida na próxima seção). Após 24 horas, utilizar embriões a ...

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	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

Cérebro de bovino é o material mais amplamente utilizado de partida 11 para purificar full-length cinesina, embora cérebro de murídeo tem sido utilizado como bem 12. Uma grande desvantagem da utilização de cérebro de bovino como fonte de cinesina é a disponibilidade de material de partida fresco: matadouros são tipicamente inacessível, eo cérebro deve ser extremamente fresco, a fim de obter cinesina activo. Além disso, apenas os cérebros de vacas jovens são eficazes. Finalmente, a man...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar (granulado) </td><td> Pescador </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose (D-glucose) anidro </td><td> Pescador </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> As placas de Petri </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> Estilo 60x15mm (Poliéster) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila Cultura frascos </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copo Tricorn </td><td> Econo Lab Inc. </td><td> B700-100 </td><td> Volume: 100 ml, Tamanho: 58x72mm </td></tr><tr><td> Levedura </td><td> Red Star </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Malha de nylon </td><td> Genesse Científico </td><td> 57-102 </td><td> 120 micron tamanho de poro </td></tr><tr><td> Malha de nylon </td><td> Peças pequenas </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (anidro) </td><td> Pescador </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotonin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP analógico 5&#39;-ciclase imidodiphosphate </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros Amicon ultracentrífugo: 0,5 mL, 100kD cortados, 8 embalagens </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

Proteínas motoras mover cargas ao longo dos microtúbulos, e transportá-los às especificidades sub-celulares locais. Como o transporte alteradas é sugerido para subjacentes uma variedade de doenças neurodegenerativas, compreendendo microtúbulo base de transporte do motor e da sua regulação, provavelmente, em última análise, levar a abordagens terapêuticas melhoradas. Cinesina-1 é uma proteína do motor eucariótica que se move numa direcção anterógrada (plus-fim) ao longo de microtúbulos (MTS), alimentado por hidrólise de ATP. Relatamos aqui um protocolo de purificação para isolar detalhada cinesina comprimento activo total a partir de embriões de Drosophila, permitindo assim que a combinação de Drosophila genética com molécula única estudos biofísicos. Começando com cerca de 50 copos de poedeiras, com cerca de 1000 mulheres por xícara, foram realizadas coletas durante a noite. Isto forneceu cerca de 10 ml de embriões embalados. Os embriões foram lixívia dechorionated (rendendo aproximadamente 9 gramas de embriões), e, em seguida, homogeneizada. Afperturbação ter, o homogeneizado foi clarificada usando uma velocidade de centrifugação de baixa seguido por uma centrifugação de alta velocidade. O sobrenadante clarificado foi tratada com GTP e taxol para polimerizar MTs. Cinesina foi imobilizada em polimerizada MTs adicionando o análogo de ATP, 5&#39;-ciclase imidodiphosphate à temperatura ambiente. Depois de cinesina de ligação, os microtúbulos foram sedimentadas por meio de centrifugação a alta velocidade através de uma almofada de sacarose. O sedimento de microtúbulos foi então re-suspenso, e este processo foi repetido. Finalmente, o ATP foi adicionado para libertar o cinesina a partir do MTs. Centrifugação a alta velocidade, em seguida, centrifugadas a MTS, deixando a cinesina no sobrenadante. Este cinesina foi submetido a uma filtração centrífuga usando um corte 100 KD fora do filtro para a purificação adicional, aliquotadas, encaixe congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Electroforese em gel SDS e Western blotting foi realizada utilizando a amostra purificada. A actividade motora das amostras purificadas antes e após o passo de filtração final centrífugafoi avaliada usando um ensaio in vitro única molécula de microtúbulos. As fracções cinesina antes e depois da filtração centrífuga mostrou processabilidade como previamente relatados na literatura. Outros experimentos estão em andamento para avaliar a interação entre cinesina e outras proteínas de transporte relacionados.

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Este é um protocolo para isolar cinesina comprimento ativo total de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões de molécula única estudos biofísicos. Nós mostramos como coletar embriões, faça o lisado embrião, e depois polimerizar microtúbulos (MTs). Cinesina é purificado por imobilizando-a sobre o MTS, fiação para baixo os complexos cinesina MT-e, em seguida libertando o cinesina a partir do MTs via adição de ATP.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biologia

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Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

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Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

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Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

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Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

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For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

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Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...