Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر تيفاني الكرز في مساعدتها في تحسين هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المعهد الوطني للشيخوخة (AG032320) ، وكذلك النهوض أكثر صحة ولاية ويسكونسن.

الرجوع إلى الشكل 1 لالتخطيطي الأساسي لبداية الإجراء مع جناسة. الوقت المقدر من إعداد مقتطفات من الخليوي الى شطف CAM متجهة البروتينات حوالي 6-7 ساعات. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن شرائح الحصين ?...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

البروتوكول شريطة يستخدم CAM - sepharose الخرز للتحقيق في كا 2 + الاعتماد على كاميرا ملزم البروتينات. العديد من البروتينات ربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. هذه التفاعلات هي ذات أهمية كبيرة نظرا لعدد CAM ملزم البروتينات ودورها الحيوي في العديد من مسارات الإ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> المنتج </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تلاحظ </td></tr><tr><td> كالمودولين - Sepharose الخرز </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للكناس CaMKII ألفا </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة neurogranin </td><td> ميليبور </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> نصائح هلام تحميل الماصة </td><td> الصياد </td><td> 02-707-138 </td><td> استخدامه لتطلع supernatants </td></tr><tr><td> أنابيب Microcentrifuge (2.0 مل) </td><td> الصياد </td><td> 05-408-146 </td><td> استخدام لجميع الخطوات التي تنطوي على كالمودولين - sepharose الخرز </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

الكالسيوم (كا 2 +) هو ايون حيويا في تنظيم وظيفة الخلوية من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. الكثير من الكالسيوم 2 + هو بوساطة من خلال إشارات البروتين الكالسيوم الملزمة المعروفة 1،2 (CAM) كالمودولين. وتشارك CAM على مستويات متعددة في جميع العمليات الخلوية تقريبا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، والتمثيل الغذائي ، على نحو سلس تقلص العضلات ، اللدونة متشابك والنمو العصبي ، والتهاب والاستجابة المناعية. وهناك عدد من البروتينات تساعد على تنظيم هذه المسارات من خلال تفاعلها مع كاميرا. كثير من هذه التفاعلات تعتمد على التشكل من كاميرا ، والتي تختلف اختلافا واضحا عندما منضما إلى الكالسيوم 2 + (كا 2 + - CAM) مقابل حالته + خالية كا 2 (ApoCaM) 3. في حين أن معظم البروتينات الهدف ربط كا 2 + كام ، ربط بروتينات معينة فقط لApoCaM. كاميرا من خلال ربط بعض المجال الذكاء ، بما في ذلك neuromodulin 4 ، neurogranin (نغ) 5 ، وبعض myosins <sup&gt; 6. وقد تبين أن هذه البروتينات تلعب دورا هاما في وظيفة قبل المشبكي 7 ، 8 وظيفة بعد المشبكي ، وتقلص العضلات 9 ، على التوالي. قدرتها على ربط وإطلاق كاميرا في غياب أو وجود الكالسيوم 2 + لها دور محوري في وظيفتها. في المقابل ، ربط العديد من البروتينات فقط كا 2 + - CAM ، وتتطلب هذه ملزمة لتفعيلها. وتشمل الأمثلة على ضوء سلسلة الميوسين كيناز 10 ، كا 2 + / CAM التي تعتمد على كاينيسات (CaMKs) 11 وphosphatases (مثل الكالسينيورين (calcineurin)) 12 ، وإسبكترن كيناز 13 ، التي لديها مجموعة متنوعة من الآثار المباشرة والمصب 14. الآثار المترتبة على هذه البروتينات الخلوية على وظيفة غالبا ما تعتمد على قدرتها على ربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. على سبيل المثال ، نحن اختبار مدى ملاءمة NG - CAM ملزمة في وظيفة متشابك وكيف تؤثر هذه الطفرات المختلفة ملزمة. ولدت لدينا يخدع نغ GFP الموسومةالبنية مع طفرات معينة في المجال الذكاء من شأنها أن تغير قدرة نغ لربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. وقدم دراسة هذه الطفرات المختلفة لنا نظرة كبيرة في عمليات هامة تشارك في وظيفة متشابك 8،15. ومع ذلك ، في مثل هذه الدراسات ، فمن الضروري أن تثبت أن البروتينات المتحورة والربط المتوقع تغييرها لكاميرا. هنا ، نقدم طريقة لاختبار قدرة البروتينات لربط كاميرا في وجود أو عدم وجود الكالسيوم 2 + ، وذلك باستخدام وكناس CaMKII نغ كأمثلة. هذا الأسلوب هو شكل من أشكال التقارب اللوني ويشار إلى مقايسة المنسدلة CAM. ويستخدم CAM - Sepharose الخرز لاختبار البروتينات التي تربط لكاميرا وتأثير الكالسيوم 2 + على هذا الربط. حان الوقت أكثر من ذلك بكثير ويتطلب كفاءة وأقل من البروتين بالنسبة إلى العمود اللوني وفحوصات أخرى. تماما ، وهذا يوفر أداة قيمة لاستكشاف كا 2 + / CAM إشارات والبروتينات التي فيteract مع كاميرا.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

كالمودولين (CAM) المنسدلة مقايسة هو وسيلة فعالة لتحقيق التفاعل بين كام مع البروتينات المختلفة. يستخدم هذا الأسلوب CAM - sepharose الخرز لتحليل كفاءة والمحددة للكاميرا ملزم البروتينات. وهذا يوفر أداة مهمة لاستكشاف إشارات كاميرا في وظيفة الخلوية.

المنسدلة من كالمودولين ملزم البروتينات

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

تلطيخ البروتينات في الهلام

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

الطبعة Microcontact من البروتينات لبيولوجيا الخلية

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

التعبير عابرة من البروتينات عن طريق هيدرودينامي الجينات في الفئران التسليم

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...