Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Tiffany Cherry i hendes hjælp til at optimere denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Aging (AG032320) samt fremme en sundere Wisconsin.

Se figur 1 for en grundlæggende skematisk af den procedure, begyndende med homogenatet. Estimeret tid fra udarbejdelse af cellulære ekstrakter til eluering af CAM-bundne proteiner er omkring seks til syv timer. 1. Tissue forberedelse <ol><li> Injicér organotypiske hippocampus skiver med en virus, der indeholder en plasmid udtrykke det rekombinante protein af interesse (i dette eksempel, grønne fluorescerende protein (GFP)-mærkede Ng) og tillade væv til at udtrykke proteiner natten ov...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Den medfølgende protokol anvender Cam-sepharose perler til at undersøge de Ca 2 +-afhængighed af Cam-bindende proteiner. Mange proteiner binder Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. Disse interaktioner er af stor betydning i betragtning af antallet af Cam-bindende proteiner og deres kritiske rolle i mange signalveje. I denne protokol, er Cam-sepharose perler bruges til at adskille CAM-bindende proteiner fra væv Homogenatet i tilstedeværelse eller fravær af Ca 2 +. Resultaterne af denne ...

<table border="1"><tr><td> Produkt </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Noter </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose perler </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Loading pipettespidser </td><td> Fisher </td><td> 02-707-138 </td><td> Brug for aspiration af supernatanter </td></tr><tr><td> Mikrocentrifugerør (2,0 ml) </td><td> Fisher </td><td> 05-408-146 </td><td> Brug for alle trin, der involverer calmodulin-sepharose perler </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcium (Ca 2 +) er en ion afgørende i reguleringen af cellulære funktion gennem en række forskellige mekanismer. Meget af Ca 2 + signalering er medieret gennem calcium-bindende protein kaldet calmodulin (CAM) 1,2. Cam er involveret på flere niveauer i næsten alle cellulære processer, herunder apoptose, stofskifte, glat muskel sammentrækning, synaptisk plasticitet, nerve vækst, inflammation og immunrespons. En række af proteiner hjælper med at regulere disse veje gennem deres interaktion med CAM. Mange af disse interaktioner afhænger af kropsbygning af Cam, som er markant anderledes, når bundet til Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) i modsætning til sin Ca 2 +-fri tilstand (ApoCaM) 3. Mens de fleste target-proteiner binder Ca 2 +-Cam, visse proteiner, der kun binder til ApoCaM. Nogle binder Cam gennem deres IQ-domænet, herunder neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, og visse myosins <sup&gt; 6. Disse proteiner har vist sig at spille en vigtig rolle i præsynaptiske funktion 7, postsynaptiske funktion 8, og muskelsammentrækning 9, hhv. Deres evne til at binde og frigive cam i fraværet eller tilstedeværelsen af Ca 2 + er omdrejningspunktet i deres funktion. I modsætning hertil kun mange proteiner binder Ca 2 +-Cam og kræver dette bindende for deres aktivering. Som eksempler kan nævnes myosin lyskæde kinase 10, Ca 2 + / CAM-afhængige kinaser (CaMKs) 11 og fosfataser (f.eks calcineurin) 12, og spectrin kinase 13, som har en bred vifte af direkte og downstream effekter 14. Virkningerne af disse proteiner på cellefunktion ofte er afhængige af deres evne til at binde sig til Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. For eksempel testede vi relevansen af ​​Ng-CAM bindende i synaptic funktion og hvordan forskellige mutationer påvirker denne binding. Vi genererede et GFP-tagget Ng construct med specifikke mutationer i IQ-domæne, der ville ændre evne Ng til at binde Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. Undersøgelsen af disse forskellige mutationer gav os stor indsigt i vigtige processer, der er involveret i synaptiske funktion 8,15. Men i sådanne undersøgelser, er det vigtigt at vise, at det muterede proteiner har den forventede ændret binding til CAM. Her præsenteres en metode til at teste evnen af proteiner til at binde sig til cam i tilstedeværelse eller fravær af Ca 2 +, ved hjælp af CaMKII og Ng som eksempler. Denne metode er en form for affinitetskromatografi omtales som en CAM pull-down assay. Det bruger CAM-Sepharose perler til at teste proteiner, der binder til Cam og indflydelsen af Ca 2 + på denne bindende. Det er betydeligt mere tid effektiv og kræver mindre protein i forhold til søjlekromatografi og andre analyser. Alt i alt, dette giver et værdifuldt redskab til at udforske Ca 2 + / CAM signalering og proteiner, der igende effekter med CAM.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulin (CAM) pull-down-analysen er en effektiv måde at undersøge samspillet mellem Cam med forskellige proteiner. Denne metode bruger CAM-sepharose perler for en effektiv og specifik analyse af CAM-bindende proteiner. Dette giver et vigtigt værktøj til at udforske Cam signalering i cellulære funktion.

Pull-down af Calmodulin-bindende proteiner

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Oprensning af Affinity-mærkede rekombinante proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Levende Imaging af GFP-mærkede proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Forbigående ekspression af proteiner ved Hydrodynamisk Gene Delivery i mus

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerende proteiner for Multipleksede Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...