Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

De auteurs willen graag Tiffany Cherry bedanken in haar te helpen bij het optimaliseren van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door National Institute of Aging (AG032320), evenals het bevorderen van een gezondere Wisconsin.

Zie figuur 1 voor een basis-schema van de procedure te beginnen met de homogenaat. Geschatte tijd vanaf de voorbereiding van de cellulaire extracten om elutie van CAM-gebonden eiwitten is ongeveer zes tot zeven uur. 1. Tissue voorbereiding <ol><li> Injecteer organotypische hippocampale plakken met een virus met een plasmide dat het recombinante eiwit van belang (in dit voorbeeld, groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Ng) en laat een nacht weefsel te drukken eiwit. </li><li> Ongeveer 12 ...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

De verstrekte protocol maakt gebruik van CaM-sepharose kralen te onderzoeken van de Ca 2 +-afhankelijkheid van de CAM-bindende eiwitten. Veel eiwitten binden CaM in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Deze interacties zijn van groot belang gezien het aantal van de Cam-bindende eiwitten en hun kritische rol in vele signaleringsroutes. In dit protocol zijn CaM-sepharose kralen gebruikt voor het CAM-bindende eiwitten te scheiden van weefsel homogenaat in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca 2 +.</su...

<table border="1"><tr><td> Product </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Opmerkingen </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose kralen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CaMKII Alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel wordt geladen Pipet Tips </td><td> Visser </td><td> 02-707-138 </td><td> Gebruik voor aspiratie van supernatantia </td></tr><tr><td> Microcentrifugebuizen (2,0 ml) </td><td> Visser </td><td> 05-408-146 </td><td> Te gebruiken voor alle stappen met betrekking tot calmodulin-sepharose kralen </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcium (Ca 2 +) is een ion van vitaal belang bij het ​​reguleren van cellulaire functie door een verscheidenheid van mechanismen. Een groot deel van Ca 2 + signalering wordt gemedieerd door de calcium-bindende eiwit bekend als calmodulin (CAM) 1,2. CaM is betrokken op verschillende niveaus in bijna alle cellulaire processen, met inbegrip van apoptose, metabolisme, gladde spiercontractie, synaptische plasticiteit, zenuwgroei, ontsteking en de immuunrespons. Een aantal van de eiwitten helpen reguleren deze routes door hun interactie met Cam. Veel van deze interacties zijn afhankelijk van de conformatie van CAM, dat is duidelijk anders wanneer gebonden aan Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) in tegenstelling tot de Ca 2 +-vrije staat (ApoCaM) 3. Terwijl de meeste doelwit eiwitten binden Ca 2 +-CAM, bepaalde eiwitten binden aan ApoCaM. Sommige binden CaM door middel van hun IQ-domein, met inbegrip neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, en bepaalde myosins <sup&gt; 6. Deze eiwitten is aangetoond dat ze een belangrijke rol in presynaptische functie 7, postsynaptische functie 8, en samentrekken van de spieren 9 te spelen, respectievelijk. Hun vermogen om te binden en laat CaM in de afwezigheid of aanwezigheid van Ca 2 + staat centraal in hun functie. In tegenstelling tot vele eiwitten binden Ca 2 +-CaM en vereisen deze binding voor hun activering. Voorbeelden hiervan zijn myosine lichte keten kinase 10, Ca 2 + / CAM-afhankelijke kinasen (CaMKs) 11 en fosfatasen (bijv. calcineurine) 12, en spectrin kinase 13, die een verscheidenheid van directe en downstream effecten 14 hebben. De effecten van deze eiwitten op cellulaire functie zijn vaak afhankelijk van hun vermogen om te CaM te binden in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Bijvoorbeeld, testten we de relevantie van Ng-CaM verbindend in synaptische functie en hoe de verschillende mutaties deze binding beïnvloeden. We genereerden een GFP-gelabelde Ng construct met specifieke mutaties in het IQ-domein dat het vermogen van Ng om CaM te binden in een Ca 2 +-afhankelijke manier zou veranderen. De studie van deze verschillende mutaties gaf ons veel inzicht in belangrijke processen die betrokken zijn bij synaptische functie 8,15. Echter, in deze studies, is het essentieel om aan te tonen dat de gemuteerde eiwitten de verwachte gewijzigde binding aan CaM hebben. Hier presenteren we een methode voor het testen van het vermogen van proteïnen om naar CaM te binden in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca 2 +, met behulp van CaMKII en Ng als voorbeelden. Deze methode is een vorm van affiniteitschromatografie aangeduid als een CAM pull-down test. Het maakt gebruik van CAM-Sepharose kralen om te testen eiwitten die zich binden aan CaM en de invloed van Ca 2 + op deze bindend. Het is aanzienlijk meer tijd efficiënter en vereist minder eiwit ten opzichte van kolomchromatografie en andere testen. Alles bij elkaar levert dit een waardevol instrument is om Ca 2 + verkennen / CAM-signalering en eiwitten die interact met CAM.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmoduline (CAM) pull-down test is een effectieve manier om de interactie van CaM te onderzoeken met verschillende eiwitten. Deze methode maakt gebruik van CAM-sepharose kralen voor een efficiënte en specifieke analyse van de CAM-bindende eiwitten. Dit levert een belangrijk instrument om CaM signalering verkennen in cellulaire functie.

Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektroforetische scheiding van eiwitten

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Kleuring Eiwitten in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Voorbijgaande expressie van eiwitten door Hydrodynamic Gene Levering in Muizen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...