Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Tiffany cerise dans son aide à l&#39;optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par l&#39;Institut national du vieillissement (AG032320) ainsi que l&#39;avancement une meilleure santé du Wisconsin.

Reportez-vous à la Figure 1 pour un schéma de base de la procédure depuis le broyat. Estimation du temps de la préparation d&#39;extraits cellulaires à élution de protéines liées CaM est d&#39;environ six à sept heures. 1. Préparation des tissus <ol><li> Injecter organotypiques coupes d&#39;hippocampe par un virus contenant un plasmide exprimant la protéine recombinante d&#39;intérêt (dans cet exemple, la protéine fluorescente verte (GFP)-taggés Ng) et permettent d&#39;expri...

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	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Le protocole fourni utilise CaM-sépharose perles pour enquêter sur le Ca 2 +-dépendance de la CaM des protéines de liaison. De nombreuses protéines se lient dans une CaM Ca 2 +-dépendante. Ces interactions sont d&#39;une grande importance étant donné le nombre de CaM des protéines de liaison et leur rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation. Dans ce protocole, Cam-sépharose perles sont utilisées pour séparer des protéines de liaison de la CaM d&#39;homogénat de tissu en ...

<table border="1"><tr><td> Produit </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Remarques </td></tr><tr><td> La calmoduline-sépharose perles </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CaMKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranine </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Conseils Gel Loading Pipet </td><td> Fisher </td><td> 02-707-138 </td><td> Utilisez pour l&#39;aspiration de surnageants </td></tr><tr><td> Tubes de centrifugation (2,0 ml) </td><td> Fisher </td><td> 05-408-146 </td><td> Utiliser pour toutes les étapes impliquant la calmoduline-sépharose perles </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Le calcium (Ca 2 +) est un ion essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire à travers une variété de mécanismes. Beaucoup de Ca 2 + de signalisation est médiée par la protéine liant le calcium connu comme la calmoduline (CaM) 1,2. Cam est impliqué à plusieurs niveaux dans presque tous les processus cellulaires, y compris l&#39;apoptose, le métabolisme, la contraction des muscles lisses, la plasticité synaptique, la croissance des nerfs, l&#39;inflammation et la réponse immunitaire. Un certain nombre de protéines aident à réguler ces voies grâce à leur interaction avec la CaM. Beaucoup de ces interactions dépendent de la conformation de came, qui est nettement différente lorsqu&#39;il est lié à Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) par opposition à sa Ca 2 + sans état ​​(ApoCaM) 3. Alors que la plupart des protéines cibles se lient Ca 2 +-CaM, certaines protéines ne se lient à ApoCaM. Certains CaM lient par leur QI-domaine, y compris neuromodulin 4, neurogranine (Ng) 5, et certaines myosines <sup&gt; 6. Ces protéines ont été montré à jouer un rôle important dans la fonction présynaptique 7, fonction postsynaptique 8 et 9 contraction des muscles, respectivement. Leur capacité à se lier et libérer Cam en l&#39;absence ou la présence de Ca 2 + est le pivot de leur fonction. En revanche, de nombreuses protéines ne se lient Ca 2 +-CaM et nécessitent cette liaison pour leur activation. Les exemples incluent la myosine kinase à chaîne légère 10, Ca 2 + / CaM-kinases dépendantes (CaMKs) 11 et les phosphatases (par exemple la calcineurine) 12, et la spectrine kinase 13, qui ont une variété d&#39;effets directs et aval 14. Les effets de ces protéines sur la fonction cellulaire sont souvent dépendants de leur capacité à se lier à Cam dans un Ca 2 +-dépendante. Par exemple, nous avons testé la pertinence de Ng-CAM obligatoire dans la fonction synaptique et la façon dont les mutations affectent différentes cette liaison. Nous avons généré une con-GFP taggés Ngstruct avec des mutations spécifiques dans le IQ-domaine qui allait changer la capacité de se lier Ng CAM dans une Ca 2 +-dépendante. L&#39;étude de ces différentes mutations nous a donné une grande perspicacité dans les processus importants impliqués dans la fonction synaptique 8,15. Cependant, dans de telles études, il est essentiel de démontrer que les protéines mutées ont altéré la liaison prévue à Cam. Ici, nous présentons une méthode pour tester la capacité des protéines à se lier à Cam en présence ou en absence de Ca 2 +, en utilisant CaMKII et Ng comme exemples. Cette méthode est une forme de chromatographie d&#39;affinité appelé CaM déroulant dosage. Il utilise la CaM-Sépharose perles de tester les protéines qui se lient à came et l&#39;influence de Ca 2 + sur cette liaison. Il est temps considérablement plus efficace et nécessite moins de protéine par rapport à la chromatographie colonne et d&#39;autres épreuves. Au total, cela donne un outil précieux pour explorer Ca 2 + de signalisation Cam / et de protéines que dansteract avec Cam.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmoduline (CaM) pull-down test est un moyen efficace pour étudier l&#39;interaction de la CAM avec diverses protéines. Cette méthode utilise la CaM-sépharose perles pour une analyse efficace et spécifique des protéines liant la CaM. Cela fournit un outil important d&#39;explorer de signalisation CAM dans la fonction cellulaire.

Pull-down des protéines se liant à la calmoduline

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

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