Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Tiffany Cherry nel suo aiuto per ottimizzare questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Aging (AG032320) così come Avanzando un più sano Wisconsin.

Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema di base della procedura a partire con l&#39;omogeneizzato. Tempo stimato dalla preparazione di estratti cellulari a eluizione di Cam-bound proteine ​​è di circa 6-7 ore. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Iniettare organotipica fettine di ippocampo con un virus che contiene un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse (in questo esempio, proteina fluorescente verde (GFP)-tagged Ng) e permettono di esprimere la proteina d...

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	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Il protocollo fornito utilizza CaM-sefarosio perline per indagare il Ca 2 +-dipendenza di CaM proteine ​​leganti. Molte proteine ​​si legano CaM in Ca 2 +-dipendente. Queste interazioni sono di grande importanza dato il numero di proteine ​​che legano CaM e il loro ruolo fondamentale in molte vie di segnalazione. In questo protocollo, Cam-sefarosio perline vengono utilizzate per separare CaM-binding proteins da tessuto omogenato in presenza o in assenza di Ca 2 +. I risultati...

<table border="1"><tr><td> Prodotto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Note </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharose perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-alfa CaMKII </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Loading Pipettare Consigli </td><td> Pescatore </td><td> 02-707-138 </td><td> L&#39;uso per l&#39;aspirazione di surnatanti </td></tr><tr><td> Microprovette (2,0 ml) </td><td> Pescatore </td><td> 05-408-146 </td><td> Utilizzare per tutte le fasi che coinvolgono calmodulina-sefarosio perline </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcio (Ca 2 +) è uno ione fondamentale nella regolazione della funzione cellulare attraverso una varietà di meccanismi. Gran parte del Ca 2 + segnalazione è mediato attraverso la proteina legante il calcio conosciuto come calmodulina (CaM) 1,2. CaM è coinvolta a più livelli in quasi tutti i processi cellulari, tra cui l&#39;apoptosi, il metabolismo, la contrazione della muscolatura liscia, la plasticità sinaptica, la crescita dei nervi, l&#39;infiammazione e la risposta immunitaria. Un certo numero di proteine ​​aiutano a regolare queste vie attraverso la loro interazione con la CaM. Molte di queste interazioni dipende dalla conformazione della CAM, che è nettamente diverso quando si lega al Ca 2 + (Ca 2 +-Cam), in opposizione alla sua Ca 2 + libero stato (ApoCaM) 3. Mentre la maggior parte delle proteine ​​bersaglio legano Ca 2 +-CAM, solo alcune proteine ​​si legano ai ApoCaM. Alcuni CaM si legano attraverso il loro IQ-dominio, tra cui neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e alcuni miosine <sup&gt; 6. Queste proteine ​​hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella funzione presinaptica 7, funzione post-sinaptici 8, e la contrazione muscolare 9, rispettivamente. La loro capacità di legare e rilasciare CaM in assenza o in presenza di Ca 2 + è fondamentale nella loro funzione. Al contrario, molte proteine ​​si legano solo Ca 2 +-CAM e necessitano di questo legame per la loro attivazione. Gli esempi includono miosina chinasi della catena leggera 10, Ca 2 + / CaM chinasi-dipendenti (CaMKs) 11 e fosfatasi (ad esempio calcineurina) 12, e spettrina chinasi 13, che hanno una varietà di effetti diretti ed a valle 14. Gli effetti di queste proteine ​​sulla funzione cellulare dipendono spesso dalla loro capacità di legarsi al CaM in Ca 2 +-dipendente. Per esempio, abbiamo testato la rilevanza di Ng-CAM obbligatorio in funzione sinaptica e di come diverse mutazioni influenzano questa associazione. Abbiamo generato un GFP-tagged con Ngstruct con mutazioni specifiche nel IQ-dominio che avrebbe cambiato la capacità di Ng di legare CaM in Ca 2 +-dipendente. Lo studio di queste mutazioni diverse ci ha dato grande intuizione in importanti processi coinvolti nella funzione sinaptica 8,15. Tuttavia, in tali studi, è essenziale per dimostrare che le proteine ​​mutate hanno atteso il legame alterato per CAM. Qui vi presentiamo un metodo per testare la capacità delle proteine ​​di legarsi al CaM in presenza o in assenza di Ca 2 +, con CaMKII e Ng come esempi. Questo metodo è una forma di cromatografia di affinità indicato come un pull-down assay CaM. Utilizza CaM-Sepharose perline per testare le proteine ​​che si legano CaM e l&#39;influenza di Ca 2 + su questa associazione. E &#39;molto più tempo efficiente e richiede meno proteine ​​rispetto alla cromatografia su colonna, ed altri test. Complessivamente, questo fornisce un valido strumento per esplorare Ca 2 + / CaM e proteine ​​di segnalazione che interact con CaM.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulina (CaM) pull-down saggio è un modo efficace per studiare l&#39;interazione del CAM con varie proteine. Questo metodo utilizza CaM-sefarosio perle per l&#39;analisi efficiente e specifica di CaM proteine ​​leganti. Questo fornisce un importante strumento per esplorare segnalazione CaM in funzione cellulare.

Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

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Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

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