Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

저자는이 프로토콜을 최적화하는 그녀의 도움 티파니 체리 감사드립니다. 이 작품은 국립 노화 연구소 (AG032320)뿐만 아니라 건강한 위스콘신를 발전하여 기금을했다.

homogenate와 프로 시저 시작의 기본 도식 1 그림을 참조하십시오. 세포 추출물의 준비에서 CAM 바인딩된 단백질의 용출에 예상 시간은 약 6~7시간 있습니다. 1. 조직 준비 <ol><li> 재조합 단백질의 관심 (이 예제에서는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 잉)과 조직이 야간 단백질을 표현할 수있는 표현 플라스미드를 포함하는 바이러스 organotypic hippocampal 조각 주사. </li><li> 약 12-18시간 바...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

제공된 프로토콜은 칼슘이 캠 결합 단백질의 + - 의존도를 조사하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 활용합니다. 많은 단백질은 칼슘 2 +에 의존 방식으로 카메라를 바인딩합니다. 이러한 상호 작용 카메론 바인딩 단백질과 많은 신호 경로에서 중요한 역할의 수를 주어진 매우 중요 있습니다. 이 프로토콜에서는 CAM - 세파 로스 비즈는 칼슘 2 +의 존재 또는 부재의 조직 ...

<table border="1"><tr><td> 제품 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td> Calmodulin - 세파 로스 비즈 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CamKII 알파 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> 겔로드 Pipet 도움말 </td><td> 어부 </td><td> 02-707-138 </td><td> supernatants의 흡인에 사용 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브 (2.0 ML) </td><td> 어부 </td><td> 05-408-146 </td><td> calmodulin - 세파 로스 비즈를 포함한 모든 단계에 사용 </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

칼슘 (칼슘 2 +)은 다양한 메커니즘을 통해 세포 기능을 조절에 중요한 이온입니다. 대부분 칼슘 2는 + 신호는 calmodulin (CAM) 1,2로 알려진 칼슘 결합 단백질을 통해 중재 수 있습니다. 캠은 apoptosis, 신진 대사, 부드러운 근육 수축, 신경 소성, 신경 성장, 염증과 면역 반응을 포함한 거의 모든 세포 공정에서 여러 수준에서 참여합니다. 단백질의 숫자 카메론와의 상호 작용을 통해 이러한 경로를 조절 도움이됩니다. 이러한 상호 작용의 대부분은 칼슘으로서 칼슘 2 + 무료 상태 (ApoCaM) 3 반대 2 + (CA 2 + - CAM)에 바인딩 할 때 분명히 다릅니다 캠의 형태에 따라 달라집니다. 대부분의 대상 단백질이 칼슘 2에 바인딩하는 동안 + - 캠, 특정 단백질에만 ApoCaM에 바인딩. neuromodulin 4 neurogranin (잉) 5, 및 특정 myosins 포함한 IQ 도메인을 통해 어떤 바인딩 캠, <sup&gt; 6. 이러한 단백질은 각각 presynaptic 기능 7, postsynaptic 기능 8, 및 근육 수축 9 중요한 역할을하기 위해 표시되었습니다. 바인딩 및 CA 2의 부재 또는 존재에 카메라를 공개 + 능력들은 함수에서 중요한 것입니다. 반대로, 많은 단백질은 칼슘 2 + 카메라를 바인딩하고 활성화에 대한 구속력이 필요합니다. 예 마이 오신 경쇄 키나제 10, 칼슘 2 + / CAM 의존 kinases (CaMKs) 11 phosphatases (예 : calcineurin) 12, 그리고 직접 및 다운 스트림 효과 14 다양한있다 spectrin 키나제 13가 포함됩니다. 세포 기능에 이러한 단백질의 효과는 종종 칼슘 2 +에 의존 방식으로 CAM에 바인딩 자신의 능력에 따라 달라집니다. 예를 들어, 우리는 다른 변이가이 바인딩을 영향을 미치는지 시냅스 기능에 잉 - CAM 바인딩의 관련성을 테스트합니다. 우리는 GFP - 태그 잉 죄수를 생성칼슘 2 +에 의존 방식으로 카메라를 바인딩하는 잉의 능력을 변경할 것입니다 IQ 도메인에서 특정 돌연변이와 구조체. 이러한 서로 다른 돌연변이 연구는 시냅스 기능 8,15에 관련된 중요한 프로세스에 우리에게 큰 통찰력을 주었다. 그러나, 이러한 연구에서, 그것은 변이된 단백질은 CAM에 대한 기대 변경된 구속력이 있는지 입증하는 것이 필수적입니다. 여기서는 예제로 CaMKII과 잉을 사용하여, CA 2 +의 존재 또는 부재에서 CAM에 바인딩하는 단백질의 기능을 테스트하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 캠 풀다운 분석이라고 친화도 크로마 토그래피의 한 형태입니다. 그것은 CAM과 +이 바인딩에 대한 칼슘 2의 영향에 바인딩 단백질을 테스트하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 사용합니다. 그것은 효율적인 상당히 더 많은 시간을하고 칼럼 크로마 토그래피 및 기타 assays에 상대적으로 적은 단백질을 필요로합니다. 모두, 이것은 + / CAM 신호 및 단백질 거기에 칼슘 2 탐험하는 중요한 도구를 제공합니다CAM과 teract.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulin (CAM) 풀다운 분석은 다양한 단백질과 CAM의 상호 작용을 조사하기 위해 효과적인 방법입니다. 이 방법은 캠 결합 단백질의 효과적이고 구체적인 분석을 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 사용합니다. 이것은 세포 기능의 CAM 신호를 탐험하기위한 중요한 도구를 제공합니다.

풀다운 Calmodulin 결합 단백질의

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

단백질의 전기 영동 분리

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

연구

생물학

Staining Proteins in Gels

젤의 단백질 염색법

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

세포 생물학을위한 단백질의 Microcontact 인쇄

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성<em&gt; 체외</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...