Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Tiffany Cherry i hjelpe henne i å optimalisere denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Aging (AG032320) samt Advancing et sunnere Wisconsin.

Se figur 1 for en grunnleggende skjematisk av prosedyren begynner med homogenate. Beregnet tid fra forberedelse av mobilnettet ekstrakter til eluering av CAM-bundet proteiner er rundt seks til syv timer. 1. Tissue forberedelse <ol><li> Injiser organotypic hippocampus skiver med et virus som inneholder et plasmid uttrykker rekombinant protein av interesse (i dette eksempelet, grønt fluorescerende protein (GFP)-merket Ng) og la vevet å uttrykke protein over natten. </li><li> Omtrent 12 til...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Den leveres Protokollen benytter CAM-sepharose perler å undersøke Ca 2 +-avhengighet av CAM-bindende proteiner. Mange proteiner binder Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. Disse interaksjonene er av stor betydning gitt antall CAM-bindende proteiner og deres kritiske rolle i mange signalveier. I denne protokollen, er CAM-sepharose perler brukes til å skille CAM-bindende proteiner fra vev homogenate i nærvær eller fravær av Ca 2 +. Resultatene av denne enkle tilnærming vil videre forstå...

<table border="1"><tr><td> Produkt </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Merknader </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose perler </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alfa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Loading Pipet Tips </td><td> Fisher </td><td> 02-707-138 </td><td> Bruk for aspirasjon av supernatants </td></tr><tr><td> Mikrosentrifugerør (2,0 ml) </td><td> Fisher </td><td> 05-408-146 </td><td> Bruk for alle trinnene involverer calmodulin-sepharose perler </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Kalsium (Ca 2 +) er et ion viktig i regulering cellular funksjon gjennom en rekke mekanismer. Mye av Ca 2 + signalering er formidlet gjennom kalsium-bindende protein kalt calmodulin (CAM) 1,2. Cam er involvert på flere nivåer i nesten alle cellulære prosesser, herunder apoptose, metabolisme, glatt muskel sammentrekning, synaptisk plastisitet, nerve vekst, betennelse og immunrespons. En rekke proteiner bidra til å regulere disse banene gjennom deres interaksjon med Cam. Mange av disse interaksjonene avhengig av konformasjon av Cam, som er tydelig forskjellig når bundet til Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) i motsetning til sin Ca 2 +-Free State (ApoCaM) 3. Mens de fleste target proteiner binde Ca 2 +-Cam, visse proteiner bare binder seg til ApoCaM. Noen binder CAM gjennom sine IQ-domene, inkludert 4 neuromodulin, neurogranin (Ng) 5, og visse myosins <sup&gt; 6. Disse proteinene har vist seg å spille viktige roller i presynaptiske funksjon 7, postsynaptiske funksjon 8 og muskel sammentrekning 9, henholdsvis. Deres evne til å binde og frigjøre Cam i fravær eller tilstedeværelse av Ca 2 + er sentrale virkemidler i sin funksjon. I motsetning til mange proteiner bare binde Ca 2 +-Cam og krever dette bindende for aktivering sine. Eksempler myosin lett kjede kinase 10, Ca 2 + / CAM-avhengige kinaser (CaMKs) 11 og fosfataser (f.eks kalsineurin) 12, og spectrin 13 kinase, som har en rekke direkte og nedstrøms effekter 14. Effektene av disse proteinene på cellular funksjon er ofte avhengig av deres evne til å binde seg til Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. For eksempel, testet vi relevansen av Ng-CAM bindende i synaptiske funksjon og hvordan ulike mutasjoner påvirker dette bindende. Vi genererte en GFP-merket Ng construct med spesifikke mutasjoner i IQ-domene som ville endre evne til Ng å binde Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. Studiet av disse ulike mutasjoner ga oss god innsikt i viktige prosesser involvert i synaptic funksjon 8,15. Men i slike studier, er det viktig å vise at de muterte proteinene har forventet endret binding til Cam. Her presenterer vi en metode for testing evne til proteiner til å binde til CAM i nærvær eller fravær av Ca 2 +, med CaMKII og Ng som eksempler. Denne metoden er en form for tilhørighet kromatografi referert til som en CAM pull-down analysen. Den bruker CAM-Sepharose perler å teste proteiner som binder seg til CAM og påvirkning av Ca 2 + på denne bindingen. Det er betydelig mer tidseffektiv og krever mindre protein i forhold til kolonne kromatografi og andre analyser. Samlet gir dette et verdifullt verktøy for å utforske Ca 2 + / CAM signalering og proteiner som iteract med Cam.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulin (CAM) pull-down-analysen er en effektiv måte å undersøke samspillet av Cam med ulike proteiner. Denne metoden bruker CAM-sepharose perler for effektiv og spesifikk analyse av CAM-bindende proteiner. Dette gir et viktig verktøy for å utforske Cam signalering i cellulære funksjon.

Pull-down of calmodulin-bindende proteiner

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Rensing av Affinity-merket rekombinante proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Lever Imaging av GFP-merket Proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Gående uttrykk av proteiner ved Hydrodynamisk Gene Levering i Mus

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk strekkoding med Fluorescent Proteiner for multiplekset Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...