Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a Tiffany Cereja em sua ajuda na otimização deste protocolo. Este trabalho foi financiado pelo National Institute of Aging (AG032320), bem como Avançando um Wisconsin saudável.

Consulte a Figura 1 para um esquema básico do início procedimento com o homogeneizado. Tempo estimado desde a preparação de extratos celulares para eluição de Cam-bound proteínas é de cerca de 6-7 horas. 1. Preparação dos tecidos <ol><li> Injetar organotípicas fatias do hipocampo com um vírus que contém um plasmídeo expressando a proteína recombinante de interesse (neste exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) marcadas Ng) e permitir que o tecido que expressam a proteín...

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	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. 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Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

O protocolo fornecido utiliza CaM-sepharose contas para investigar o Ca 2 + dependência da CaM proteínas de ligação. Muitas proteínas se ligam CaM em uma Ca 2 + forma-dependente. Essas interações são de grande importância dado o número de CaM proteínas de ligação e seu papel crítico em muitas vias de sinalização. Neste protocolo, CaM-sepharose contas são usadas para separar CaM proteínas de ligação a partir de homogeneizado de tecido na presença ou ausência de Ca 2 +.</su...

<table border="1"><tr><td> Produto </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharose contas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Dicas Pipetar Loading </td><td> Pescador </td><td> 02-707-138 </td><td> Use para aspiração de sobrenadantes </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga (2,0 mL) </td><td> Pescador </td><td> 05-408-146 </td><td> Use para todas as etapas que envolvem a calmodulina-sepharose contas </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Cálcio (Ca 2 +) é um íon vital na regulação da função celular através de uma variedade de mecanismos. Muito do Ca 2 + de sinalização é mediada através da proteína de ligação de cálcio conhecido como calmodulina 1,2 (CaM). CaM está envolvido em vários níveis em quase todos os processos celulares, incluindo apoptose, o metabolismo, a contração do músculo liso, plasticidade sináptica, o crescimento do nervo, inflamação e da resposta imune. Uma série de proteínas ajudam a regular essas vias através de sua interação com CaM. Muitas dessas interações dependem da conformação da CAM, que é distintamente diferente quando ligado a Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) em oposição à sua Ca 2 + estado livre (ApoCaM) 3. Enquanto a maioria das proteínas-alvo bind Ca 2 +-CaM, algumas proteínas só se ligam a ApoCaM. Alguns ligam-se através CaM seu QI de domínio, incluindo neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e miosinas certos <sup&gt; 6. Essas proteínas têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na função pré-sináptica 7, função pós-sinápticos 8, e 9 a contração muscular, respectivamente. Sua capacidade de ligar e liberar CaM na ausência ou presença de Ca 2 + é central na sua função. Em contraste, muitas proteínas se ligam apenas Ca 2 +-CaM e exigem esta ligação para sua ativação. Exemplos incluem a quinase da cadeia leve da miosina 10, Ca 2 + / CaM quinases dependentes (CaMKs) 11 e fosfatases (por exemplo, da calcineurina) 12, e espectrina quinase 13, que tem uma variedade de efeitos diretos e jusante 14. Os efeitos destas proteínas em função celular são muitas vezes dependentes de sua capacidade de se ligar a CaM em Ca 2 + forma-dependente. Por exemplo, testamos a relevância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica e como diferentes mutações afetam essa ligação. Geramos uma GFP-tagged con Ngstruct com mutações específicas no IQ-domínio que iria mudar a capacidade de Ng para ligar CaM em Ca 2 + forma-dependente. O estudo destas mutações diferentes nos deu grande insight sobre processos importantes envolvidos na função sináptica 8,15. No entanto, em tais estudos, é essencial para demonstrar que as proteínas mutantes têm a ligação esperada alterado para CaM. Aqui, apresentamos um método para testar a capacidade de se ligar a proteínas CaM na presença ou ausência de Ca 2 +, usando CaMKII e Ng como exemplos. Este método é uma forma de cromatografia de afinidade referido como um ensaio CaM pull-down. Ele usa CaM-Sepharose contas para testar as proteínas que se ligam ao CaM e à influência de Ca 2 + em essa ligação. É tempo consideravelmente mais eficiente e requer menos proteínas em relação a cromatografia de coluna e outros ensaios. Ao todo, este fornece uma valiosa ferramenta para explorar Ca 2 + / CaM sinalização e proteínas que, emteract com CaM.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.

Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

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