Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Tiffany de la cereza en su ayuda en la optimización de este protocolo. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Envejecimiento (AG032320), así como el avance de una mejor salud de Wisconsin.

Refiérase a la Figura 1 para un esquema básico de principios procedimiento con el homogeneizado. Tiempo estimado de preparación de extractos celulares de elución de la CAM con destino proteínas es de aproximadamente seis a siete horas. 1. Preparación de tejidos <ol><li> Inyectar organotípicos rodajas de hipocampo con un virus que contiene un plásmido que expresa la proteína recombinante de interés (en este ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados Ng) y permitir ...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

El protocolo al que se utiliza CAM-sepharose bolas para investigar la Ca 2 +-dependencia de la CAM-proteínas de unión. Muchas proteínas se unen una webcam en una Ca 2 +-dependiente. Estas interacciones son de gran importancia dada la cantidad de proteínas de unión a CaM y su papel fundamental en muchas vías de señalización. En este protocolo, la CAM-sepharose bolas se utilizan para separar la CaM proteínas de unión a partir de tejido homogeneizado en la presencia o ausencia de Ca 2 +...

<table border="1"><tr><td> Producto </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharosa cuentas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-alfa CamKII </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranina </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Consejos Cargando Pipet </td><td> Pescador </td><td> 02-707-138 </td><td> El uso de la aspiración de sobrenadantes </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga (2,0 ml) </td><td> Pescador </td><td> 05-408-146 </td><td> Uso de todos los pasos que involucran la calmodulina-sefarosa cuentas </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcio (Ca 2 +) es un ion fundamental en la regulación de la función celular a través de una variedad de mecanismos. Gran parte de Ca 2 + señalización está mediada por la proteína de unión a calcio se conoce como la calmodulina (CaM) 1,2. CAM está involucrado en múltiples niveles en casi todos los procesos celulares, incluyendo la apoptosis, el metabolismo, la contracción del músculo liso, la plasticidad sináptica, el crecimiento del nervio, la inflamación y la respuesta inmune. Una serie de proteínas ayudan a regular estas vías a través de su interacción con la CAM. Muchas de estas interacciones dependen de la conformación del CAM, que es muy diferente cuando se une a Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) en oposición a su Ca 2 +-estado libre (ApoCaM) 3. Aunque la mayoría de las proteínas diana se unen Ca 2 +-CAM, sólo ciertas proteínas se unen a ApoCaM. Algunos CAM se unen a través de su coeficiente intelectual es de dominio, incluyendo neuromodulin 4, neurogranina (Ng) 5, y algunas miosinas <sup&gt; 6. Estas proteínas se ha demostrado que juegan un papel importante en la función presináptica 7, la función postsináptica 8, 9 y la contracción muscular, respectivamente. Su capacidad para unirse y liberación de CAM en la ausencia o presencia de Ca 2 + es fundamental en su función. Por el contrario, muchas proteínas sólo se unen Ca 2 +-CAM y requieren este enlace para su activación. Los ejemplos incluyen la cinasa de la cadena ligera de miosina 10, Ca 2 + / CaM-quinasas dependientes (CaMK) 11 y fosfatasas (por ejemplo, la calcineurina) 12, y espectrina quinasa 13, que tienen una variedad de efectos directos y aguas abajo 14. Los efectos de estas proteínas en la función celular a menudo dependen de su capacidad para unirse a la CAM en una Ca 2 +-dependiente. Por ejemplo, hemos probado la relevancia de Ng-CAM vinculante en la función sináptica y cómo las diferentes mutaciones afectan a esta unión. Hemos generado una estafa GFP-etiquetados Ngestructura con mutaciones específicas en el CI en el dominio que iba a cambiar la capacidad de Ng a unirse una webcam en una Ca 2 +-dependiente. El estudio de estas mutaciones diferentes nos dio una gran comprensión de los procesos importantes que intervienen en la función sináptica 8,15. Sin embargo, en estos estudios, es esencial para demostrar que las proteínas mutadas se espera que la unión a CaM alterado. A continuación, presentamos un método para probar la capacidad de las proteínas que se unen a CAM en la presencia o ausencia de Ca 2 +, con CaMKII y Ng como ejemplos. Este método es una forma de cromatografía de afinidad a que se refiere como una cámara desplegable ensayo. Utiliza CAM-Sepharosa cuentas para poner a prueba las proteínas que se unen a la leva y la influencia de Ca 2 + en este enlace. Es un tiempo considerablemente más eficiente y requiere menos proteína en relación con la cromatografía de columna y otros ensayos. En conjunto, esto proporciona una valiosa herramienta para explorar Ca 2 + / CAM y señalización de las proteínas que, encontrarrestar con la CAM.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulina (CaM) pull-down de ensayo es una forma efectiva para investigar la interacción de la CAM con varias proteínas. Este método utiliza CAM-sepharose bolas para el análisis eficiente y específica de la CAM-proteínas de unión. Esta es una importante herramienta para explorar la señalización CAM en la función celular.

Desplegable de proteínas de unión a calmodulina

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

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