Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Författarna vill tacka Tiffany Cherry i hennes hjälp för att optimera detta protokoll. Detta arbete har finansierats av National Institute of Aging (AG032320) samt vidareutveckla ett hälsosammare Wisconsin.

Se figur 1 för en grundläggande schematisk av förfarandet börjar med homogenatet. Beräknad tid från förberedelse av cellulära extrakt till eluering av CAM-bundna proteiner är ungefär sex till sju timmar. 1. Tissue förberedelse <ol><li> Injicera organotypic hippocampus skivor med ett virus som innehåller en plasmid som uttrycker rekombinant protein av intresse (i detta exempel, grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta Ng) och låt vävnad att uttrycka proteinet natten. </li><...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Den som protokollet använder CAM-sepharose pärlor att undersöka Ca2 +-beroende av CAM-bindande proteiner. Många proteiner binder Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Dessa interaktioner är av stor betydelse med tanke på antalet CAM-bindande proteiner och deras avgörande roll i många signalvägar. I detta protokoll är CAM-sepharose pärlor används för att separera CAM-bindande proteiner från vävnader homogenatet i närvaro eller frånvaro av Ca 2 +. Resultaten av denna enkla metod...

<table border="1"><tr><td> Produkt </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Anteckningar </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose pärlor </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Laddar Pipettera tips </td><td> Fisher </td><td> 02-707-138 </td><td> Används för aspiration av supernatanterna </td></tr><tr><td> Mikrocentrifugrör (2,0 ml) </td><td> Fisher </td><td> 05-408-146 </td><td> Använd för alla steg som berör calmodulin-sepharose pärlor </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Kalcium (Ca 2 +) är en jon viktigt i regleringen av cellulära funktioner genom olika mekanismer. Mycket av Ca 2 + är signalering förmedlas via kalcium-bindande protein som kallas calmodulin (CAM) 1,2. Cam är inblandade på flera nivåer i nästan alla cellulära processer, inklusive apoptos, metabolism, smidig muskel kontraktion, synaptisk plasticitet, nerv tillväxt, inflammation och immunsvaret. Ett antal proteiner hjälper till att reglera dessa vägar genom deras interaktion med CAM. Många av dessa interaktioner beror på konformation av CAM, vilket är helt olika när de är bundna till Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) i motsats till sin Ca2 +-fri stat (ApoCaM) 3. Medan de flesta målproteiner binder Ca 2 +-CAM, vissa proteiner binder endast till ApoCaM. Några binder CAM genom deras IQ-domän, inklusive neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, och vissa myosins <sup&gt; 6. Dessa proteiner har visat sig spela en viktig roll i presynaptiska funktion 7, postsynaptisk funktion 8 och muskelkontraktion 9, respektive. Deras förmåga att binda och frigöra cam i frånvaron eller närvaron av Ca 2 + är avgörande för deras funktion. Däremot många proteiner binder bara Ca2 +-CAM och kräver detta bindande för deras aktivering. Exempel myosin lätta kedjan kinas 10, Ca 2 + / CAM-kinaser (CaMKs) 11 och fosfataser (t.ex. kalcineurin) 12, och spectrin kinas 13, som har olika direkta och nedströms effekter 14. Effekterna av dessa proteiner cellens funktion är ofta beroende av deras förmåga att binda till Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Exempelvis testade vi betydelsen av Ng-CAM bindande i synapserna och hur olika mutationer påverkar denna bindning. Vi genererade en GFP-märkta Ng construct med specifika mutationer i IQ-domän som skulle förändra möjligheten för Ng att binda Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Studiet av dessa olika mutationer gav oss stor insikt i viktiga processer som ingår i synapserna 8,15. Men i sådana studier är det viktigt att visa att de muterade proteiner har den förväntade ändrade bindning till CAM. Här presenterar vi en metod för att testa förmågan hos proteiner att binda till cam i närvaro eller frånvaro av Ca 2 +, med hjälp CaMKII och Ng som exempel. Denna metod är en form av affinitetskromatografi kallad CAM pull-down-analysen. Den använder CAM-Sepharose pärlor för att testa proteiner som binder till CAM och påverkan av Ca 2 + på denna bindande. Det är betydligt mer tidseffektivt och kräver mindre protein i förhållande till kolonnkromatografi och andra analyser. Sammantaget ger detta ett värdefullt verktyg för att utforska Ca 2 + / CAM-signalering och proteiner som imotverka med CAM.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulin (CAM) pull-down-analys är ett effektivt sätt för att undersöka samspelet mellan CAM med olika proteiner. Denna metod använder CAM-sepharose pärlor för effektiv och specifik analys av CAM-bindande proteiner. Detta ger ett viktigt verktyg för att utforska CAM signalering i cellulär funktion.

Pull-down för calmodulin proteiner

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektrofores separation av proteiner

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Infärgning Proteiner i Geler

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Microcontact utskrift av proteiner för cellbiologi

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Hög genomströmning Rening av Affinity-märkta rekombinanta proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Transient Expression av proteiner från Hydrodynamisk Gene Delivery hos möss

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerande proteiner för Multiplexade Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Immunofluorescens Analys av endogena och exogena centromer-kinetochore proteiner

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...