Name: pull-down of calmodulin-binding proteins
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Yazarlar, bu protokol optimize ona yardım Tiffany Kiraz teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (AG032320) yanı sıra Sağlıklı Wisconsin ilerlemek tarafından finanse edildi.

Homojenat prosedür başından temel bir şematik Şekil 1 bakın. Elüsyon CaM bağlı proteinler, hücre ekstreleri hazırlanması için tahmini süre yaklaşık altı-yedi saat. 1. Doku hazırlanması <ol><li> Organotipik hipokampal dilim ilgi rekombinant protein (bu örnekte, yeşil flüoresan protein (GFP) etiketli Ng) ve doku gecede protein ifade etmek için izin ifade eden bir plazmid içeren bir virüs enjekte edilir. </li><li> Yaklaşık 12 ila 18 saat viral enjeksiyondan sonra (v...

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Ca 2 +-CaM-bağlayıcı proteinlerin bağımlılığı araştırmak için sağlanan protokol CaM-sepharose boncuk kullanır. Çoğu protein, Ca 2 +-bağımlı bir şekilde CaM bağlanır . Bu etkileşimler CaM-bağlayıcı proteinlerin ve birçok sinyal yolakları kritik bir rol sayısı göz önüne alındığında büyük önem taşımaktadır. Bu protokol, CaM-sepharose boncuk CaM-bağlayıcı proteinlerin varlığı ya da yokluğu, Ca 2 + doku Homojenat ayırmak için kullanılır . ...

<table border="1"><tr><td> Ürün </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Kalmodulin-sepharose boncuk </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alfa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Jel Yükleniyor pipetleyin İpuçları </td><td> Balıkçı </td><td> 02-707-138 </td><td> Süpernatantlar aspirasyonu için kullanın. </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj tüpleri (2.0 ml) </td><td> Balıkçı </td><td> 05-408-146 </td><td> Kalmodulin-sepharose boncuklar içeren tüm adımları için kullanın </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Kalsiyum (Ca 2 +), çeşitli mekanizmalar aracılığıyla hücresel fonksiyonları düzenleyen hayati bir iyon . Ca 2 + sinyalizasyon kalmodulin (CaM) 1,2 olarak bilinen kalsiyum-bağlayıcı protein aracılığıyla. CaM apoptoz, metabolizma, düz kas kasılması, sinaptik plastisite, sinir büyüme, enflamasyon ve immün yanıt da dahil olmak üzere hemen hemen tüm hücresel süreçleri birden fazla seviyelerde yer almaktadır. Proteinlerin bir dizi CaM ile etkileşim yoluyla bu yollar düzenlenmesine yardımcı olurlar. Bu etkileşimlerin bir çoğu, Ca 2 +, Ca 2 +-devlet (ApoCaM) 3 karşı (Ca 2 +-CaM) bağlı farklı CaM, konformasyon bağlıdır . Çoğu hedef proteinlere Ca 2 bağlama iken + CaM, bazı proteinler sadece ApoCaM bağlamak. Neuromodulin 4, neurogranin (Tr) 5, ve belirli Miyosinler de dahil olmak üzere kendi IQ etki alanı ile Bazı bağlama CaM <sup&gt; 6. Bu proteinler, sırasıyla, presinaptik fonksiyonu 7, 8 postsinaptik fonksiyonu, ve kas kasılması 9 önemli rol oynamaktadır gösterilmiştir . Bağlamak ve Ca 2 varlığı veya yokluğu CaM serbest + yeteneklerini kendi fonksiyonu çok önemlidir. Buna karşılık, birçok proteinler sadece Ca 2 +-CaM bağlamak ve onların aktivasyonu için bu bağlayıcı gerektirir. Örnekler miyozin hafif zincir kinaz 10, Ca 2 + / CaM-bağımlı kinazlar (CaMKs) 11 ve fosfatazlar (örneğin kalsinörin) 12 ve 14 doğrudan ve mansap etkileri bir çeşitlilik var spectrin kinaz 13, içerir. Bu proteinlerin hücre fonksiyonu üzerinde etkileri genellikle CaM Ca 2 +-bağımlı bir şekilde bağlamak için yeteneklerini bağlıdır. Örneğin, farklı mutasyon bu bağlayıcı nasıl etkilediğini sinaptik fonksiyon Tr-CaM bağlama uygunluğu test edilmiş ve. Biz bir GFP etiketli Ng con oluşturulanNg, Ca 2 +-bağımlı bir şekilde CaM bağlamak yeteneğini değiştirmek istiyorsunuz IQ etki alanında belirli mutasyonları ile yapı . Sinaptik fonksiyon 8,15 yer alan önemli süreçler, bu farklı mutasyonlar çalışma bize büyük bir fikir verdi. Ancak, bu tür çalışmaların, mutasyona uğramış proteinler CaM beklenen değiştirilmiş bağlayıcı sahip olduklarını göstermeleri şarttır. Burada, örnek olarak CaMKII ve Ng kullanarak, Ca 2 + varlığı ya da yokluğu CaM bağlamak için proteinlerin yeteneğini test etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem afinite kromatografisi CaM açılan test olarak adlandırılan bir form. CaM-sepharose boncuk CaM ve Ca 2 + bağlayıcı bir etkisi bağlayan proteinleri test etmek için kullanır. Bu verimli, çok daha fazla zaman ve kolon kromatografisi ve diğer testleri göre daha az protein gerektirir. Toplamda, bu Ca 2 + / CaM sinyalizasyon ve proteinlerin ki keşfetmek için değerli bir araç sağlarCaM ile teract.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Kalmodulin (CAM) açılan test CaM çeşitli proteinler ile etkileşimi araştırmak için etkili bir yoldur. Bu yöntem, etkili ve spesifik CaM-bağlayıcı proteinlerin analizi için CaM-sepharose boncuk kullanır. Bu hücresel fonksiyonları CaM sinyal keşfetmek için önemli bir araç sağlar.

Kalmodulin bağlayıcı Proteinler, Pull-down

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Jeller içinde Proteinler Boyama

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Proteinlerin Hücre Biyolojisi Microcontact Baskı

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...