Name: intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
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हम इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा, डा. Nuno मोरेनो के लिए रसद Foxp3 की GFP / GFP की तरह के दान के लिए हमारे पशु धारक और हीटिंग पैड और डॉ. विजय कुमार Kuchroo बनाने में मदद के लिए धन्यवाद डॉ. डेविड Olivieri करना चाहते हैं चूहों. यह काम &quot;Fundação पैरा Ciência ई TECNOLOGIA&quot; (FCT, पुर्तगाल), अनुदान PTDC/EBB-BIO/115514/2009 # द्वारा समर्थित है.

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	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इस पत्र में हम एक जीवित जानवरों के अंदर thymocytes के दो photon इमेजिंग के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया. हम भी कुछ पैरामीटर है कि एक सावधानी से नियंत्रण चाहिए जैसे रक्त के प्रवाह की निरंतरता और इमेजिंग प्रक्रियाओं के दौरान अंग तापमान के रखरखाव, वर्णित है. बहरहाल, सावधान अंग को स्थिर रखने के प्रयासों के बावजूद, &quot;अंग बहती&quot; के रूप में गति कलाकृतियों हो सकता है. पोस्टीरियर छवि सुधार विशेष रूप से इस प्रयोजन के लिए डिजाइन एल्गोरिदम के विकास के द्वारा किया जा सकता है. इसके अलावा छवि विश्लेषण भी नए प्रोटोकॉल के विकास का स्रोत है जो त्रुटियों को कम करना चाहता है हो सकता है. थाइमस जहां सभी टी कोशिकाओं का उत्पादन कर रहे हैं, इसलिए अंग है, यह अंग जहां प्रतिरक्षाविज्ञानी γδ की पीढ़ी को समझने में दिलचस्पी है, CD4, या CD8 टी कोशिकाओं अपना ध्यान केंद्रित करेंगे. सबसे टी कोशिकाओं के विषय में अध्ययन की संख्या में मतभेद और / या इन ग के स्थिरता पर आधारित हैं/ इन विट्रो में vivo में जोड़तोड़ में विभिन्न बाद ells. हालाँकि, केवल में vivo दृश्य के बाद हम 3-7 homeostasis को बनाए रखने में शामिल प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं के बीच बातचीत का पालन सकता है. इसलिए, thymocytes के vivo अवलोकन में शायद एक सबसे महत्वपूर्ण लापता जानकारी के लिए बेहतर टी कोशिका जीव विज्ञान को समझने की . Intravital TPM टी सेल आंदोलनों और बातचीत का एक विस्तृत चित्र प्रदान करता है और हम यहाँ का प्रदर्शन कैसे यह विस्तृत thymocyte अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हर तकनीक की अपनी सीमाएं है. जबकि intravital इमेजिंग अधिग्रहण शरीर के अंदर की कोशिकाओं के व्यवहार को दर्शाती के लिए सबसे सही प्रणाली है, यह भी सच है कि अंगों की छवि अधिग्रहण explanted कम श्रमसाध्य है और प्रतिरक्षा प्रणाली 8,9 के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी एकत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, एक इनकार नहीं कर सकता intravital तरीकों इमेजिंग सर्जरी की आवश्यकता anesthetized पशुओं में ऊतकों और रक्त वाहिकाओं का पर्दाफाश,से प्रति जो पूरे अंग फिजियोलॉजी 10 में एक परिवर्तन का कारण बन सकता है. फिर भी, वहाँ गैर invasively तरीकों कि शल्य चिकित्सा प्रक्रिया 11 और नए तरीकों की वजह से कलाकृतियों को समाप्त कर रहे हैं विकसित किया जा रहा हैं कि बेहतर अग्रिम में तैयार 12 इस्तेमाल किया जा पशुओं. इसलिए, नए शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं और tolls या कम से कम intravital इमेजिंग अधिग्रहण के वास्तविक सीमाओं बाईपास होगा और अधिक से अधिक वैज्ञानिक समुदाय के लिए सुलभ हो. हमने दिखा दिया है कि हम विधि वर्णित है संभव है और यह vivo में प्रणालीगत जोड़तोड़, ऐसी दवा प्रशासन में सभी रिपोर्टों, कि हम इस्तेमाल किया है. इस प्रकार, हम इस पद्धति का उपयोग के साथ पूर्व vivo पहले से ही उपलब्ध तकनीक के साथ क्रम में करने के लिए पूरक हैं और आगे thymocytes विकास के विषय में अध्ययन को मजबूत सुझाव है.

<table border="1"><thead><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rhodamine ishothiocyanate Dextran बी </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> R9379 </td><td> 20 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक तैयार </td></tr><tr><td> दो - फोटोन खुर्दबीन </td><td> प्रेयरी टेक्नोलॉजीज इंक </td><td> प्रेयरी चरम XY </td><td></td></tr><tr><td> लेजर तिवारी: नीलम </td><td> इंक, सुसंगत </td><td> गिरगिट अल्ट्रा परिवार </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 एनए विसर्जन का उद्देश्य </td><td> ओलिंप इंक </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> धारक (फ़िल्टर Dichroic /) </td><td> Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन </td><td> BX2 91018 (यू - MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 फि़ल्टर्स </td><td> Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 फिल्टर </td><td> Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 एनएम dichroic </td><td> Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris सॉफ्टवेयर </td><td> Bitplane एजी इंक </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer इंक </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> एनआईएच, यूएसए </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

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Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

हम उपन्यास प्रयोगशाला उपकरणों और thymus के intravital इमेजिंग अधिग्रहण के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया है. हमारी तकनीक थाइमस जहां टी सेल विकास होता है के भीतर &quot;niches&quot; की पहचान में मदद करनी चाहिए.

माउस 2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग thymus के intravital इमेजिंग

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

वंक्षण लिम्फ नोड के intravital माइक्रोस्कोपी

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2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग संक्रमित फेफड़े में neutrophils द्वारा phagocytosis और NET गठन के प्रत्यक्ष अवलोकन

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

प्लीहा के intravital माइक्रोस्कोपी: परजीवी गतिशीलता और रक्त प्रवाह के मात्रात्मक विश्लेषण

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

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Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

कीटाणु केन्द्रों की अत्यधिक हल intravital धारीदार रोशनी माइक्रोस्कोपी

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

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निम्नलिखित जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग<em&gt; लीशमैनिया</em&gt; संक्रमण: यकृत hemodynamics के एक आकलन

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Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

CXCR6.Gfp रिपोर्टर चूहों का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त जिगर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लॉन्ग टर्म intravital Multiphoton माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

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का विश्लेषण<em&gt; यर्सीनिया enterocolitica</emमेजबान कोशिकाओं में&gt; प्रेरक translocation बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक Fusions का उपयोग

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

रीयल टाइम में anaesthetized चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा Mesenteric रगों में न्यूट्रोफिल और monocytes इमेजिंग

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² Promoter-driven DsRed Reporter Mice

न्युट्रोफिल भड़काना के intravital इमेजिंग आईएल 1β प्रमोटर संचालित DsRed रिपोर्टर चूहों का उपयोग

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...