Name: intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Оливьери для критического обзора этой рукописи, доктор Нуно Морено для логистического помочь построить наш держатель животного и грелки и д-р Виджай К. Kuchroo за добрые пожертвования Foxp3-KI GFP / GFP мышей. Эта работа проводится при поддержке &quot;Fundação пункт Ciencia электронной Tecnologia&quot; (ПКТ, Португалия), грант № PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

<ol>
	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

В этой статье мы показали, процедуры для двухфотонного изображений тимоцитах внутри живого животного. Мы также описаны некоторые параметры, которые следует тщательно контролировать, например, продолжение притока крови и поддержание органов температуры во время визуализации процедур. Тем не менее, несмотря на тщательную усилия для поддержания стабильного органа, артефакты движения, такие как &quot;орган дрейфует&quot; может произойти. Задняя коррекции изображения может осуществляться разработка алгоритмов, специально предназначенные для этой цели. Дальнейший анализ изображения также могут быть источником развития новых протоколов, которые стремится свести к минимуму ошибки. Тимус является органом, где все Т-клетки производят и, следовательно, это орган, в котором иммунологов, заинтересованных в понимании поколения γδ, CD4, CD8, или Т-клетки будут сосредоточить свое внимание. Большинство исследований, касающихся Т-клеток, основанные на различиях в номера и / или стабильности этих злоктя, после различных в пробирке / в естественных условиях манипуляций. Однако только после визуализации в естественных условиях мы могли наблюдать взаимодействие между клетками иммунной системы, участвующих в поддержании гомеостаза 3-7. Таким образом, в естественных условиях наблюдения тимоцитов, вероятно, один из самых важных недостающую информацию, чтобы лучше понять Т клеточной биологии. Прижизненное TPM обеспечивает детальную картину движения Т клеток и взаимодействия, и мы здесь продемонстрировать, как он может быть использован для подробного исследования тимоцитов. Однако каждый метод имеет свои ограничения. Хотя прижизненного приобретения изображений является наиболее точной системой для отражения поведения клетки внутри тела, это также верно, что эксплантированных получения изображения органов является менее трудоемким и была использована для сбора важной информации об иммунной системе 8,9. Более того, нельзя отрицать, прижизненной методов визуализации требуют хирургического вмешательства, чтобы подвергать ткани и кровеносные сосуды в анестезии животных,которая сама по себе может привести к изменению в физиологии целого органа 10. Тем не менее, Есть неинвазивным методам, которые отменяют артефактов, вызванных хирургическая процедура, 11 и новые методы в настоящее время разрабатываются, что лучше подготовиться заранее, животных, которые будут использоваться 12. Таким образом, новых хирургических процедур и сборов позволит свести к минимуму или обойти ограничения фактического приобретения прижизненного изображения и становиться все более и более доступными для научного сообщества. Мы показали, что метод, который мы описали возможно, и сообщает обо всех в естественных условиях системных манипуляций, например введения лекарства, которые мы использовали. Таким образом, мы предлагаем использовать этот метод вместе с экс методы естественных условиях уже доступны для того, чтобы дополнять и укреплять дальнейшие исследования, касающиеся тимоцитах развития.

<table border="1"><thead><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr></thead><tbody><tr><td> Родамина Б ishothiocyanate-Декстран </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> подготовить запас в дозе 20 мг / мл </td></tr><tr><td> Двухфотонное микроскопом </td><td> Prairie Технологии ООО </td><td> Prairie Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: Sapphire лазер </td><td> Когерентные, Inc </td><td> Chameleon Ультра семьи </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 Н. А. погружения цель </td><td> Olympus ООО </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Организатор (Фильтры / дихроичным) </td><td> Chroma технологий корпорации </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 фильтр </td><td> Chroma технологий корпорации </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 фильтр </td><td> Chroma технологий корпорации </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 нм дихроичных </td><td> Chroma технологий корпорации </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris программного обеспечения </td><td> Bitplane AG ООО </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer ООО </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, США </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

Двухфотонное микроскопия (TPM) обеспечивает получение изображений в глубоководных районах внутри тканей и органов. В сочетании с разработкой новых инструментов стереотаксической и хирургических процедур, TPM становится мощным методом для выявления &quot;ниши&quot; внутренних органов, а также документ сотовой &quot;поведение&quot; в живых животных. Хотя прижизненного изображения содержит информацию, которая наилучшим образом напоминает реальный сотовый поведение внутри органа, это и более трудоемкий и технически сложных с точки зрения необходимого оборудования / процедур, чем альтернативные бывший приобретения естественных изображений. Таким образом, мы описываем хирургическую процедуру и роман &quot;стереотаксической&quot; орган держатель, который позволяет нам следить за движениями Foxp3 + клеток внутри тимуса. Foxp3 это главный регулятор для создания регуляторных Т-клеток (Tregs). Более того, эти клетки могут быть классифицированы в зависимости от их происхождения: то есть. тимуса дифференцированных Tregs называют &quot;природной Tregs&quot; (nTregs), а оpposed для периферического преобразован Tregs (pTregs). Несмотря на значительный объем научных исследований, как сообщается в литературе по фенотипу и физиологии этих Т-клеток, очень мало известно об их в естественных условиях взаимодействия с другими клетками. Этот недостаток может быть связано с отсутствием методов, которые позволили бы таких наблюдений. Протокол, описанный в этом документе содержится средство от этой ситуации. Наш протокол предусматривает использование голым мышам, которые испытывают недостаток эндогенного тимуса, так как они пунктуальны мутации в последовательности ДНК, что компромиссы дифференциации некоторых эпителиальных клеток, в том числе тимуса эпителиальных клеток. Обнаженная мышей гамма-облучения и восстановленного с костного мозга (КМ) от Foxp3-KI GFP / GFP мышей. После восстановления Б. М. (6 недель), каждое животное получало эмбрионального тимуса трансплантации почки внутри капсулы. После принятия тимуса (6 недель), животных под наркозом; почки содержащиепересаженные тимуса была разоблачена, зафиксированных в наш орган держателем, и держали в физиологических условиях для прижизненного изображения по TPM. Мы использовали этот подход для изучения влияния препаратов в поколение регуляторных Т-клеток.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Мы разработали новые лабораторных инструментов и протоколов для прижизненного приобретения изображений тимуса. Наша методика должна помочь в выявлении «ниш» в тимус, где T развития клетка происходит.

Прижизненное Визуализация Мышь Thymus использованием 2-Фотон микроскопии

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Прижизненные микроскопия пахового лимфатического узла

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Прямое наблюдение Фагоцитоз и NET-формации Нейтрофилы в Зараженные легкие с помощью 2-фотонной микроскопии

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Прижизненные изображения с помощью мыши подколенный лимфатический узел

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Высоко Решено Прижизненные Полосатый-подсветка микроскопия зародышевых центров

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Прижизненные микроскопия Визуализация печени следующие<em&gt; Лейшмания</em&gt; Инфекция: оценка печеночного гемодинамики

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Долгосрочная прижизненные Многофотонная микроскопия изображений иммунных клеток в здоровых и больная печень Использование CXCR6.Gfp Reporter Мыши

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Анализ<em&gt; Yersinia энтероколитные</em&gt; Эффектор Транслокация в клетки-хозяева с помощью Бета-лактамазы эффекторных Слияния

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Прижизненной визуализации нейтрофилов Грунтовка Использование IL-1 промотором управляемые Dsred Reporter Мыши

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...