Name: measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes
Uploaded: 2011-11-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health beurzen 2R01 GM53132 en P50 GM071558.

1. Het laden van cellen met calcium indicatoren <ol><li> Plaat cellen in 35mm met glazen bodem MatTek gerechten (of enige andere met glazen bodem bekijken van kamers). </li><li> Bij gebruik van primaire myocyten de vacht van de kamers een dag eerder met 10μg/ml laminine. Plaat cardiale myocyten (geïsoleerd van volwassen honden, neonatale ratten of ander organisme) in KB buffer (K-omkering Tyrode buffer 35 mmol / L van HEPES, 140 mmol / L KCl, 8 mmol / L van KHCO 3, 2 mmol / L van MgCl 2, en 0,4...

<ol>
	<li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+and+[Ca2+]i+waves+in+cardiac+myocytes.">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li><li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase.">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li><li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes.">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowded+little+caves:+structure+and+function+of+caveolae.">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li><li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+alters+Ca2++signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G{alpha}q+family+of+G+proteins.">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li><li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G[alpha]q+Interactions.">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li><li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway.">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li><li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses.">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li><li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae.">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li></ol>

We hebben een methode ontwikkeld om te bekijken en te snelle calcium-signalen te isoleren in levende hartspiercellen. Terwijl de experimentele omstandigheden van deze metingen zijn eerder toegepast op andere celsystemen 10 en cardiomyocyten 11, het gebruik van histogrammen en bin-analyse maakt het mogelijk gegevens uit vele Ca 2 + evenementen aan te schaffen. Sneller gebeurtenissen kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit langzamere en modellen aangepast aan hun onderliggende mechanisme...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomyocyten meerdere Ca 2 + fluxen van verschillende duur die samenwerken om de functie 1,2 te optimaliseren. Veranderingen in de Ca 2 +-activiteit in reactie op extracellulaire agenten wordt voornamelijk geregeld door de fosfolipase Cβ-Gα q pad gelokaliseerd op de plasmamembraan, die wordt gestimuleerd door stoffen zoals acetylcholine 3,4. We hebben onlangs ontdekt dat plasma-membraan eiwit domeinen genaamd caveolae 5,6 kan Gα q 7 vangen geactiveerd. Dit entrapment heeft het effect van de stabilisatie van de geactiveerde toestand van Gα q en resulteert in een verlengde Ca 2 +-signalen in cardiomyocyten en andere celtypes 8. We ontdekte dit verrassende resultaat door het meten van dynamische calcium antwoorden op een snelle schaal in de levende hartspiercellen. In het kort worden cellen geladen met een fluorescerende Ca 2 +-indicator. In onze studies hebben we gebruik gemaakt Ca 2 + Green (Invitrogen, Inc.), die een toename van de fluorescentie-emissie-intensiteit bij de binding van calciumionen vertoont. De fluorescentie-intensiteit wordt vervolgens opgenomen voor het gebruik van een line-scan modus van een laser scanning confocale microscoop. Deze methode maakt een snelle overname van het tijdsverloop van de fluorescentie-intensiteit in pixels langs een geselecteerde lijn, het produceren van enkele honderden van de tijd sporen op de microseconde tijdschaal. Deze zeer snelle sporen worden overgebracht naar Excel en vervolgens in Sigmaplot voor analyse, en worden vergeleken met sporen verkregen voor elektronische ruis, gratis verf, en andere controles. Te ontleden Ca 2 + reacties van verschillende fluxen, voerden we een histogram analyse die pixel intensiteiten weggegooid met de tijd. Binning laat ons toe om de groep meer dan 500 sporen van scans en visualiseren van de verzamelde resultaten van ruimte en tijd op een perceel. Zo kan de trage Ca 2 + golven die moeilijk te onderscheiden wanneer de scans worden bedekt te wijten aan verschillende piek plaatsing en geluid, gemakkelijk te zien inhet weggegooid histogrammen. Zeer snel fluxen in de tijdschaal van de meting tonen een smalle verdeling van de intensiteiten op de zeer korte tijd bakken terwijl meer Ca 2 + golven tonen weggegooid gegevens met een brede spreiding over langere tijd bakken. Deze verschillende verdelingen tijd kunnen we de timing van Ca 2 + fluxen ontleden in de cellen, en het effect daarvan te bepalen op verschillende cellulaire gebeurtenissen.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes at JoVE.com

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Wij presenteren een methode om snel (microseconde) calcium gebeurtenissen isoleren van trager stromen in levende cellen met behulp van laser scanning confocale microscopie. De methode meet fluorescentie-intensiteit schommelingen van calcium indicatoren door het opnemen van lijn scans van enkele honderden pixels in een cel. Histogram-analyse laat ons toe om te isoleren van de tijdschalen van de verschillende calcium fluxen.

Het meten van Fast Calcium stromen in cardiomyocyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Light Sheet Microscopie van snelle hartdynamica in zebravisembryo's

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...