Name: measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes
Uploaded: 2011-11-29T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt 2R01 GM53132 und P50 GM071558 unterstützt.

1. Loading-Zellen mit Calcium-Indikatoren <ol><li> Platte Zellen in 35mm Glasboden MatTek Gerichte (oder irgendeine andere Glasboden betrachten Kammern). </li><li> Bei der Verwendung von primären Myozyten Mantel der Kammern 1 Tag vor mit 10μg/ml Laminin. Platte Herzmuskelzellen (isoliert aus erwachsenen Hunden neugeborenen Ratten oder anderen Organismus) in KB-Puffer (K-Umkehr Tyrode Puffer 35 mmol / l HEPES, 140 mmol / l KCl, 8 mmol / l KHCO 3, 2 mmol / L MgCl 2 und 0,4 mmol / l KH 2</sub...

<ol>
	<li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+and+[Ca2+]i+waves+in+cardiac+myocytes.">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li><li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase.">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li><li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes.">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowded+little+caves:+structure+and+function+of+caveolae.">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li><li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+alters+Ca2++signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G{alpha}q+family+of+G+proteins.">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li><li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G[alpha]q+Interactions.">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li><li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway.">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li><li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses.">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li><li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae.">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li></ol>

Wir haben eine Methode zum Anzeigen und isolieren schnellen Calcium-Signale in lebenden Herzmuskelzellen entwickelt. Während die experimentellen Bedingungen dieser Messungen zuvor auf andere Zellsysteme 10 sowie Kardiomyozyten 11 angewendet wurde, erlaubt die Verwendung von Histogrammen und bin Analyse von Daten aus vielen Ca 2 + Veranstaltungen erworben werden. Schneller Ereignisse können leicht aus langsameren und Modelle angepasst, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Kardiomyozyten mehrere Ca 2 + Ströme von unterschiedlicher Dauer, die zusammenarbeiten, um Funktion 1,2 zu optimieren. Änderungen in Ca 2 +-Aktivität in Reaktion auf extrazelluläre Substanzen wird überwiegend durch die Phospholipase Cb-Gα q Weg auf der Plasmamembran, die durch Mittel wie Acetylcholin stimuliert 3,4 lokalisiert ist geregelt. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Plasmamembran Proteindomänen genannt Caveolae 5,6 Gα q 7 aktiviert einzufangen. Dieser Einschluss hat den Effekt der Stabilisierung des aktivierten Zustand des Gα q und was zu einer verlängerten Ca 2 +-Signale in Kardiomyozyten und anderen Zelltypen 8. Wir deckten dieses überraschende Ergebnis durch die Messung dynamischer Kalzium Antworten auf eine schnelle Skalierung in lebenden Herzmuskelzellen. Kurz gesagt, werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator geladen. In unseren Studien haben wir Ca 2 + Green (Invitrogen, Inc.), die eine Zunahme der Fluoreszenzemission Intensität der Bindung von Kalzium-Ionen aufweist. Die Intensität der Fluoreszenz wird dann für ein Line-Scan-Modus eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop aufgenommen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Erfassung des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenz-Intensität in Pixel entlang einer ausgewählten Linie, produziert mehrere hundert Mal Spuren auf die Mikrosekunde Zeitskala. Diese sehr schnell Spuren in Excel und dann in Sigmaplot zur Analyse übertragen werden, und sind die Spuren für die elektronische Rauschen, freien Farbstoff und andere Bedienelemente, verglichen. Um sezieren Ca 2 + Antworten von verschiedenen Flussraten führten wir eine Histogramm-Analyse, dass Pixelintensitäten mit der Zeit klassierte. Binning ermöglicht es uns, Gruppe über 500 Spuren überprüft und visualisieren die erarbeiteten Ergebnisse räumlich und zeitlich in einer einzigen Kurve. So kann die langsame Ca 2 + Wellen, die schwer zu erkennen sind, wenn die Scans überlagert werden durch unterschiedliche Peak Platzierung und Lärm, ohne darin zu sehen,die klassierten Histogramme. Sehr schnelle Flüsse in der Zeitskala der Messung zeigen eine enge Verteilung der Intensitäten in der sehr kurzen Zeitintervallen während mehr Ca 2 + Wellen zeigen klassierten Daten mit einer breiten Verteilung über längere Zeit zu lagern. Diese unterschiedlichen Zeit-Distributionen ermöglichen es uns, das Timing der Ca 2 + Ströme in den Zellen zu zerlegen und deren Auswirkungen auf die verschiedenen zellulären Geschehen bestimmen.

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Wir präsentieren eine Methode zur schnellen (Mikrosekunde) Calcium Ereignisse aus langsamer Flüsse in lebenden Zellen mittels Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie zu isolieren. Das Verfahren misst Fluoreszenzintensität Schwankungen des Kalzium-Indikatoren, die von der Aufnahme Line-Scans von mehreren hundert Pixel in einer Zelle. Histogramm-Analyse ermöglicht es uns, die Zeitskalen der verschiedenen Kalzium-Ströme zu isolieren.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...