Name: measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes
Uploaded: 2011-11-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend 2R01 GM53132 og P50 GM071558.

1. Laster celler med kalsium indikatorer <ol><li> Plate celler i 35mm glassbunn Mattek retter (eller andre glassbunn visning kamre). </li><li> Hvis du bruker primære myocytes pels kamrene 1 dag før med 10μg/ml laminin. Plate hjertemuskelceller (isolert fra voksne hunder, neonatal rotter eller annen organisme) i KB buffer (K-reversering Tyrode buffer 35 mmol / L av HEPES, 140 mmol / L av KCl, 8 mmol / L av 3 KHCO, 2 mmol / L av MgCl 2, og 0,4 mmol / L av KH 2 4 PO, pH 7,5) og endre d...

<ol>
	<li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+and+[Ca2+]i+waves+in+cardiac+myocytes.">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li><li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase.">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li><li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes.">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowded+little+caves:+structure+and+function+of+caveolae.">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li><li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+alters+Ca2++signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G{alpha}q+family+of+G+proteins.">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li><li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G[alpha]q+Interactions.">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li><li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway.">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li><li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses.">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li><li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae.">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li></ol>

Vi har utviklet en metode for å vise og isolere rask kalsium signaler i levende cardiomyocytes. Mens eksperimentelle betingelsene i disse målingene har tidligere vært brukt til andre celler systemer 10 samt cardiomyocytes 11, tillater bruk av histogrammer og bin analyse av data fra mange Ca 2 + arrangement skal anskaffes. Raskere hendelser kan være lett isolert fra tregere seg og modeller tilpasset for å forstå deres underliggende mekanismer. Dyrking cardiomyocytes, så mange prim?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomyocytes har flere Ca 2 + flukser av varierende varighet som samarbeider for å optimalisere funksjon 1,2. Endringer i Ca 2 + aktivitet i respons til ekstracellulær agenter er hovedsakelig regulert av fosfolipase Cβ-Gα q pathway lokalisert på plasmamembranen som stimuleres av midler som acetylkolin 3,4. Vi har nylig funnet ut at plasma membran protein domener som kalles caveolae 5,6 kan lure aktivert Gα q 7. Dette entrapment har effekten av å stabilisere aktivert tilstand av Gα q og resulterer i forlenget Ca 2 + signaler i cardiomyocytes og andre celletyper 8. Vi avdekket dette overraskende resultatet ved å måle dynamisk kalsium svar på en rask skala i levende cardiomyocytes. Kort fortalt er celler lastet med en fluorescerende Ca 2 + indikator. I våre studier, brukte vi Ca 2 + Green (Invitrogen, Inc.) som viser en økning i fluorescens utslippsintensiteten ved binding av kalsiumioner. Fluorescens intensiteten er da registrert for å bruke en line-scan mode av en laser scanning confocal mikroskop. Denne metoden tillater rask anskaffelse av tiden løpet av fluorescens intensiteten i piksler langs en valgt linje, produsere flere hundre tid spor på mikrosekund tidsskalaen. Disse svært raske spor blir overført til Excel og deretter inn Sigmaplot for analyse, og blir sammenlignet med spor innhentet for elektronisk støy, gratis fargestoff, og andre kontroller. Å dissekere Ca 2 + respons av forskjellige flux priser, utførte vi en histogram analyse som binned pixel intensiteter med tiden. Binning tillater oss å gruppere over 500 spor av skanner og visualisere den kompilerte resultater romlig og tidsmessig på en enkelt tomt. Dermed kan den langsomme Ca 2 + bølger som er vanskelig å skjelne når skanninger kledde på grunn av forskjellige topp plassering og støy, kan lett sees iden binned histogrammer. Veldig rask flukser i tiden omfanget av målingen viser en smal distribusjon av intensiteter i svært kort tid binger mens lenger Ca 2 + bølger show binned data med en bred distribusjon over lengre tid skuffer. Disse ulike tidspunkt distribusjonene tillate oss å dissekere timingen av Ca 2 + flukser i cellene, og bestemme deres innvirkning på ulike cellulære begivenheter.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes at JoVE.com

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Vi presenterer en metode for å isolere rask (mikrosekund) kalsium hendelser fra tregere flukser i levende celler ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi. Metoden måler fluorescensintensitet svingninger av kalsium indikatorer ved registrering linje skanninger av flere hundre piksler i en celle. Histogram analyse tillater oss å isolere tidsskalaer på forskjellige kalsium flukser.

Måling Rask Kalsium flukser i cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolasjon og Kv Channel Recordings i Murine Atrial og ventrikulær cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og kultur av Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling glutation-indusert Fôring Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Spenning og Kalsium Dual Channel Optisk Kartlegging av Cultured HL-en atrial myocyte med ett lag

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Måling av RAN Peptid toksisitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Fremover genetisk skjerm ved hjelp av transgen kalsium reporter aequorin å identifisere nye mål i kalsium signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Lysarkmikroskopi av rask hjertedynamikk i sebrafiskembryoer

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Måling av mitokondrie substrat flux i rekombinante perfringolysin O-permeabiliserte celler

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...