Name: measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes
Uploaded: 2011-11-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag 2R01 GM53132 och P50 GM071558.

1. Fylla celler med kalcium indikatorer <ol><li> Plate celler i 35mm Mattek glas botten rätter (eller något annat glas botten ser kammare). </li><li> Om du använder primära myocyter päls kamrarna 1 dag före med 10μg/ml laminin. Plate hjärt myocyter (isolerade från vuxna hundar, neonatala råttor, eller annan organism) i KB buffert (K-återföring Tyrode buffert 35 mmol / L av HEPES, 140 mmol / L KCl, 8 mmol / L KHCO 3, 2 mmol / L av MgCl 2 och 0,4 mmol / L av KH 2 PO 4,</...

<ol>
	<li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+and+[Ca2+]i+waves+in+cardiac+myocytes.">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li><li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase.">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li><li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes.">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowded+little+caves:+structure+and+function+of+caveolae.">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li><li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+alters+Ca2++signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G{alpha}q+family+of+G+proteins.">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li><li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G[alpha]q+Interactions.">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li><li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway.">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li><li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses.">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li><li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae.">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li></ol>

Vi har utvecklat en metod för att visa och isolera snabb kalcium signaler i levande cardiomyocytes. Medan de experimentella villkoren för dessa mätningar har tidigare använts på andra cellsystem 10 samt cardiomyocytes 11, tillåter användning av histogram och bin analys data från många Ca 2 + händelser som ska förvärvas. Snabbare händelser lätt kan isoleras från långsammare ettor och modeller anpassade för att förstå de underliggande mekanismer. Odling cardiomyocytes, s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomyocytes har flera Ca 2 + flöden av varierande längd som samverkar för att optimera funktionen 1,2. Förändringar i Ca 2 + aktivitet som svar på extracellulära agenter är främst regleras av fosfolipas Cβ-Gα q vägen lokaliserad på plasmamembranet, som stimuleras av medel såsom acetylkolin 3,4. Vi har nyligen funnit att plasmamembranet protein domäner kallas caveolae 5,6 kan snärja aktiveras Gα q 7. Detta entrapment har effekten av att stabilisera det aktiverade stadiet av Gα q och resulterar i förlängd Ca 2 +-signaler i cardiomyocytes och andra celltyper 8. Vi upptäckte detta överraskande resultat genom att mäta dynamiska kalcium svar på en snabb skala i levande cardiomyocytes. Kortfattat, är cellerna laddade med ett fluorescerande Ca 2 + indikator. I våra studier har vi använt Ca 2 + Grön (Invitrogen, Ic) som uppvisar en ökning av fluorescens utsläpp intensitet vid bindning av kalciumjoner. Fluorescensintensiteten sedan in för att använda en line-scanningsläge en laserskanning konfokalmikroskop. Denna metod gör snabba förvärv av tiden under fluorescensintensiteten i pixlar längs en markerad linje, som producerar flera hundra tiden spår på mikrosekund tidsskalan. Dessa mycket snabba spår överförs till Excel och sedan till SigmaPlot för analys, och jämförs med spår som erhålls för elektroniskt brus, utan färg, och andra kontroller. Att dissekera Ca 2 + svar av olika flux priser, genomförde vi ett histogram analys som binned pixel intensiteter med tiden. Binning tillåter oss att samla över 500 spår av skannar och visualisera sammanställt resultaten rumsligt och tidsmässigt på en enda tomt. Således kan den långsamma Ca 2 + vågor som är svåra att urskilja när genomsökningar överlagrade beror på olika topp placering och buller, lätt ses iden binned histogram. Mycket snabb flöden i tidsskala mätningen visar en smal fördelning av intensitet på mycket kort tid soptunnor medan längre Ca 2 + vågor visa binned data med en bred spridning över längre tid papperskorgar. Dessa olika tid distributioner tillåter oss att dissekera tidpunkten för Ca 2 + flöden i cellerna, och för att fastställa deras inverkan på olika cellulära händelser.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes at JoVE.com

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Vi presenterar en metod för att isolera snabb (mikrosekund) kalcium händelser från långsammare flöden i levande celler med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi. Metoden åtgärder fluorescensintensitet variationer av kalcium indikatorer skannar in raden av flera hundra pixlar i en cell. Histogram analys tillåter oss att isolera tidsskalor för olika kalcium flöden.

Mätning Snabb Kalcium flöden i Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Mätning nära plasmamembran och Global Intracellulär Dynamics Kalcium i Astrocyter

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolering och Kv Recordings Channel i murina förmaks-och ventrikulära kardiomyocyter

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering och odling av neonatala Mus Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mätning Glutation-inducerad Foder Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Spänning och Kalcium Dual Channel Optisk Kartläggning av odlade HL-1 förmaks myocyt Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Framåt genetisk skärm med transgenkalcerande kalcium reporter Aequorin att identifiera nya mål i kalcium signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Ljusplåtmikroskopi av snabb hjärtdynamik i zebrafiskembryon

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Mätning av mitokondriellt substratflöde i rekombinanta perfringolysin O-permeabiliserade celler

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...