Name: immunostaining of dissected zebrafish embryonic heart
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart at JoVE.com

Wij danken Beninio Jomok voor zijn hulp in de zebravis veehouderij. Dit werk wordt gefinancierd door NIH HL81753.

1. De voorbereiding van dia&#39;s en vochtige kamer <ol><li> De bevochtigde kamer kan worden gemaakt van een doos, zoals een leeg tip box. Wikkel zowel de kamer en het afdekken met aluminiumfolie om de monsters te beschermen tegen licht. </li><li> In de kamer, zet een stapel natte papieren zakdoekjes om de vochtigheid in de kamer, die het hart monsters te voorkomen dat het drogen te behouden. Stel een klein microplaat op de top van de papieren handdoek als een rek voor de dia&#39;s. </li><li> Teken of lijnen of cirkel...

<ol>
	<li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Zebrafish+to+human:+modular+medical+models.">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li><li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cardiac+development:+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics.">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+the+genetic+basis+of+cardiovascular+disease.">Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease.</a> Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).</li><li>Huang, W., Zhang, R., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+zebrafish+heart:+A+functional+study+of+tnnt2.">Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2.</a> Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle:+the+regulation+of+myogenesis.">Muscle: the regulation of myogenesis.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).</li><li>Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherins+and+associated+proteins.">Cadherins and associated proteins.</a> Vivo. 5, 505-513 (1991).</li><li>Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish.">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).</li><li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes.">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li><li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms.">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li></ol>

In vergelijking met klassieke ganse berg immunokleuringen methoden, onze methode heeft de volgende voordelen. Ten eerste kan veel sterker fluorescerende signalen consequent worden verkregen dankzij de verbeterde penetratie. In de ganse berg immunokleuring methode, de dichte huid weefsel rondom het hart aanzienlijk verminderd de penetratie van vele antilichamen, wat resulteert in hoge achtergrond in het hele lichaam. Dit probleem is vooral ernstig voor embryo&#39;s ouder dan drie-dagen post-bevruchting (DPF). In tegenste...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> tricaïne </td><td> Onderzoek organische </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> Formaldehyde </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td> Insulinespuit </td><td> Becton Dickinson </td><td> 329461 </td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> Anti-β-catenine antilichaam </td><td> Sigma </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> Anti-Mef2c antilichaam </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> Anti-α-actinine antilichaam </td><td> Sigma </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> Anti-Ilk antilichaam </td><td> Cell signaling </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> Alexa fluor 568 Geit anti konijn IgG </<html> td&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> Alexa fluor 488 geit anti muis lgG1 </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> Montage medium voor fluorescentie </td><td> Vector </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge pen </td><td> Vector </td><td> H-4000 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine gecoate glaasjes </td><td> Elektronenmicroscopie wetenschappen </td><td> 63410-01 </td></tr><tr><td> Microscoop afdekglas </td><td> Visser </td><td> 12 tot 543-D </td></tr><tr><td> Uitgehold objectglaasjes </td><td> Visser </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> Dissection microscoop </td><td> Leica MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> Samengestelde microscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> Apotome </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table> PBST: 1 x PBS 0,5% Triton-X 100 ENT &quot;&gt; 25X tricaïne: 400 mg tricaïne 97,9 mL DDH 2 O 2,1 ml (1 M Tris pH9) Pas de pH tot 7,0

immunostaining of dissected zebrafish embryonic heart

Zebravis embryo wordt een populair in vivo vertebrate model voor het bestuderen van ontwikkeling van het hart en het menselijk hart-en vaatziekten als gevolg van de gunstige embryologie en genetica 1,2. Ongeveer 100-200 embryo&#39;s zijn verkrijgbaar elke week vanaf een enkel paar van de volwassen vissen. De transparante embryo&#39;s ex utero ontwikkelen maken ze ideaal voor de beoordeling van hartafwijkingen 3. De expressie van een gen kan worden gemanipuleerd via morfolino technologie-of RNA-injectie 4. Bovendien, naar voren genetische screens hebben al een lijst van mutanten die verschillende perspectieven van cardiogenese 5 beïnvloeden. Whole mount immunokleuring is een belangrijke techniek in dit diermodel om de expressie patroon van de beoogde eiwit openbaren aan een bepaald weefsel 6. Echter, hebben een hoge resolutie beelden die kunnen onthullen cellulaire of subcellulaire structuren is moeilijk, vooral als gevolg van de fysieke location van het hart en de slechte penetratie van de antilichamen. Hier presenteren we een methode om deze knelpunten aan te pakken door het ontleden van het hart en vervolgens het uitvoeren van de kleuring proces op het oppervlak van een microscoop dia. Om het verlies van kleine monsters het hart te voorkomen en om de oplossing te hanteren te vergemakkelijken, beperken wij het hart monsters binnen een cirkel op het oppervlak van de microscoop dia&#39;s getrokken door een immEdge pen. Na de kleuring, kan de fluorescentie signalen direct worden waargenomen door een samengestelde microscoop. Onze nieuwe methode verbetert de penetratie voor antilichamen, want een hart van een embryonale vis slechts bestaat uit enkele cellagen. Beelden van hoge kwaliteit uit intacte hart kunnen worden verkregen binnen een veel lagere processie tijd voor zebravis embryo&#39;s de leeftijd van dag 2 tot dag 6. Onze methode kan mogelijk worden uitgebreid naar andere organen ontleed van zowel zebravis of andere kleine dieren vlek.

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart at JoVE.com

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Hart Dissection in larvale, jeugdige en volwassen zebravis, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...